º Facultad de Ciencias Veterinarias y Biológicas Carrera de Medicina Veterinaria y Zootecnia “PREVALENCIA DE ANTICUERPOS CONTRA Neospora caninum EN OVINOS DE CRIANZA EXTENSIVA DE LA SAIS TÚPAC AMARU, JUNÍN” Tesis para optar el TítuloProfesional de: MÉDICO VETERINARIO Y ZOOTECNISTA STEPHANY LIZBETH CHILGE MALLQUI BACHILLER EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA LIMA – PERÚ 2018 0 1 Contenido I. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 5 II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................... 7 1.1. Generalidades de ovinos ..................................................................................................... 7 1.2. Ovino raza Junín ........................................................................................................................... 8 1.3. Enfermedades en ovinos ........................................................................................................... 9 1.4 Neosporosis ..................................................................................................................................... 9 1.4.1. Etiología ................................................................................................................................................ 10 1.4.3. Estadios parasitarios ...................................................................................................................... 10 1.4.4 Ciclo biológico...................................................................................................................................... 12 1.4.5 Epidemiología ...................................................................................................................................... 14 1.4.6. Transmisión ......................................................................................................................................... 15 1.4.7. Patogenia.............................................................................................................................................. 17 1.4.8. Inmunidad ............................................................................................................................................. 19 1.4.9. Signos clínicos ................................................................................................................................... 22 1.4.10. Lesiones ............................................................................................................................................. 23 1.4.11. Diagnóstico ....................................................................................................................................... 24 1.4.12. Tratamiento ....................................................................................................................................... 27 1.4.13. Control ................................................................................................................................................. 28 1.4.14. Prevención ........................................................................................................................................ 28 III. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................... 30 Localización y ambiente .................................................................................................................. 30 a. Población y muestra ................................................................................................................ 30 b. Diseño experimental ................................................................................................................ 31 c. Diseños metodológicos ......................................................................................................... 31 i. Toma de muestra ................................................................................................................................ 31 ii. Procesamiento de muestras .......................................................................................................... 31 IV. RESULTADOS ..................................................................................................................... 35 V. DISCUSIÓN ............................................................................................................................ 37 VI. CONCLUSIONES ................................................................................................................ 40 VII. RECOMENDACIONES ..................................................................................................... 41 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 42 2 RESUMEN El objetivo del presente estudio es determinar la prevalencia de seropositivos de anticuerpos contra Neospora caninum en ovinos de crianza extensiva en la SAIS Túpac Amaru, Junín. Se evaluaron 367 sueros sanguíneos de ovinos provenientes de la SAIS Túpac Amaru del departamento de Junín, tomando en cuenta las variables, edad, sexo y calidad genética; las muestras fueron analizadas por la prueba ELISA indirecta para la detección de anticuerpos anti Neospora caninum, teniendo como resultado una prevalencia de 0,82% (3/367) de ovinos seropositivos a anticuerpos contra Neospora caninum. Estos resultados confirman la presencia de Neospora caninum en ovinos de la SAIS Túpac Amaru y la necesidad de nuevos estudios que identifiquen la presencia de este protozoario en explotaciones ovinas del país. 3 ABSTRACT The objective of the present study is to determine the prevalence of seropositive antibodies against Neospora caninum in sheep of extensive breeding in SAIS Túpac Amaru, Junín. We evaluated 367 blood sera from sheep from the SAIS Túpac Amaru of the department of Junín, taking into account the variables, age, sex, and genetic quality; the samples were analyzed by the indirect ELISA test for the detection of antibodies against Neospora caninum. Resulting in a prevalence of 0,82% (3/367) of seropositive sheep antibodies against Neospora caninum. These results confirm the presence of Neospora caninum in sheep of SAIS Túpac Amaru and the need for new studies that identify the presence of this protozoon in sheep farms in the country. 4 I. INTRODUCCIÓN En el Perú, la ganadería desarrollada en la región andina se caracteriza por utilizar pastos naturales y se desenvuelve principalmente en los valles interandinos, siendo en su mayoría de crianza extensiva; la especie que predomina es la ovina, existiendo una población de 9’523,198 de ovinos para el censo del 2012. Sin embargo, muestra un descenso de 21,2% a comparación de los censos agropecuarios de años anteriores; a pesar de esto, ha mantenido su presencia debido a que se integra con otros sistemas de crianza, adaptada a diversos climas, manteniéndose como un sistema de producción económicamente importante (INEI, 1994, 2012). Por lo tanto, el estudio de enfermedades relacionados a la crianza de ovinos que afectan al sistema de producción es una necesidad (Díaz y Oviedo, 2013). Dentro de estas, la neosporosis es una enfermedad causada por el protozoo Neospora caninum que tiene distribución mundial, importante por la falla reproductiva que causa y que ha sido reportada en las principales zonas productoras de ganado bovino del mundo, la cual afecta a una variedad de animales, teniendo como hospedador definitivo a los canidos, y como hospedadores intermediarios a los rumiantes, camélidos sudamericanos, équidos, entre otros. La importancia de la neosporosis ovina, se encuentra relacionada a las pérdidas productivas y reproductivas que ocasionan, relacionadas con el aborto, la reducción del número de crías paridas, la reducción en la producción láctea y de lana; a pesar de no tener la misma relevancia que en los bovinos de otras partes del mundo. Sin embargo, en territorios donde se cría bovinos y ovinos a la vez, estos últimos pueden, eventualmente, participar de la epidemiologia de la infección. En el Perú, existen varios estudios realizados sobre el Neospora caninum, siendo uno de ellos el realizado en el departamento de Junín encontrándose en llamas, bovino (Casas et al., 2006; Granados et al., 2014), donde se reportan 5 seroprevalencias variadas y con características propias. Por lo que resulta importante realizar estudios como este que permitan una evaluación epidemiológica de esta enfermedad, buscando establecer estrategias de prevención y control. 6 II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.1. Generalidades de ovinos La crianza de ovinos en el Perú tiene importancia económica, social y ecológica; representa el sustento de un gran sector de la población rural, ya que se cría en su mayoría en áreas no aptas para la agricultura y como una actividad a la par de la bovinocultura (Aliaga, 2009). En el Perú, la crianza de ovinos se ha podido mantener porque se realiza a la par que la de otros animales como vacunos y camélidos, criados encima de los 4000 m s.n.m., dentro de la economía familiar del poblador andino, sin índices de productividad favorable (Díaz y Oviedo, 2013) Según el IV Censo Nacional Agropecuario peruano, llevado a cabo en el 2012, la población ovina es de 9’523,198 de animales, mostrando un descenso de 21,2% con respecto al censo agropecuario de 1994. Los criollos es la raza de mayor población, representando el 81,0% del total. Le siguen: la raza Corriedale, con el 11,4%, la Hampshire Down, 2,6%, la Black Belly, 0,9% y otras razas, 4,1%, respectivamente. Según el INEI (1994, 2012), la mayor parte de la población de ganado ovino está concentrada en la sierra, con 8.972.200 cabezas, que representa el 94,2% del total. En la costa y la selva, la raza predominante es criollos con 79,8% y 71,3%, respectivamente. La sierra, como ya se ha mencionado, concentra una mayor cantidad de ovinos, siendo Puno, Cusco y Junín los departamentos que presentan la población de ovinos más importante. Junín presenta una población de 779.297 cabezas de ganado (INEI, 2012), siendo parte de estas criadas de manera extensiva por sociedades agrícolas, como la sociedad agrícola de interés social (SAIS) Túpac Amaru, que representa una población total de 81.533 cabezas de ganado ovino de la raza Junín. 7 En el Perú, la cadena productiva de ovino viene aumentando a una tasa promedio anual de 2,17%. Entre los años 2000 y 2012, considerándose la producción de carne, lana y piel en su conjunto, el valor bruto de la producción tuvo un crecimiento de 16,2% (Díaz y Oviedo, 2013). Con respecto a la producción de lana, esta ha disminuido notablemente en las últimas décadas y en el Perú, desde el 2001, va disminuyendo en una tasa anual de -1,88%, debido a la competencia de las fibras naturales y sintéticas, generando un bajo precio en el mercado lanero mundial, reemplazándola por actividades más rentables, (MINAGRI, 2017), como varios modelos de producción de carne para generar ingresos alternativos (Buratovich y Villa, 2004; MINAGRI, 2017). La producción de carne en el Perú va en crecimiento, registrando un incremento del 6,75% entre el año 2007 y 2012; siendo Puno, Cusco, Junín y Ayacucho los principales productores. El abastecimiento de carne en su mayoría se desarrolla de manera informal, representando un 70% de la producción nacional de carne que en su mayoría es de autoconsumo y el 30% de comercio formal (Días y Oviedo, 2013). La problemática “de la crianza de ovinos en el país radica, principalmente en los siguientes factores: baja producción y productividad, bajos índices reproductivos, escasa disponibilidad de material genético de calidad, deficiente manejo animal y sanitario” (Molina 2013: 7). 1.2. Ovino raza Junín La raza Junín fue la principal raza productiva de la SAIS Túpac Amaru, la cual tuvo sus inicios en 1952 por la Cerro de Pasco Corporation, y fue continuada por la SAIS Túpac Amaru en razón a la ley 17716 Ley General de Reforma Agraria del 30 de marzo de 1970 (Linares, 2012). Se caracteriza por ser un ovino de alta rusticidad, cuerpo robusto, buen aplomo, vellón de color blanco y de rizo uniforme; La lana debe presentar un diámetro de 20 a 28 micrones, el empadre es realizado cuando las borreguillas alcanzan un peso promedio de 40 kilos y tienen 18 meses de edad (Santiago, 2011; SAIS, 2012). 8 1.3. Enfermedades en ovinos Se sabe que existe un amplio listado de etiologías de naturaleza infecciosa, incluyendo agentes virales, parasitarios, fúngicos y bacterianos, que pueden producir importantes enfermedades en la industria ovina (Allen, 2004), entre las cuales resaltan la agalaxia contagiosa, epididimitis ovina, clamidiosis ovina, infección por el virus de la peste de pequeños rumiantes, salmonelosis, viruela ovina (OIE, 2008), estomatitis vesicular, enterotoxemia, colibacilosis, lengua azul y las parasitarias como la hidatidosis, coccidiosis, toxoplasmosis y neosporosis. 1.4 Neosporosis La neosporosis bovina es una enfermedad que se encuentra a nivel mundial, teniendo importancia por el fallo reproductivo en las principales zonas productoras de ganado bovino del planeta (Dubey et al., 2007). Se denomina neosporosis a la enfermedad causada por el protozoo Neospora caninum, el cual produce alteraciones neuromusculares en los caninos y abortos o mortalidad neonatal en los bovinos (Dubey, 1999). En 1990 se reportó el primer informe de Neospora caninum como una infección natural en ovejas, en un cordero con infección congénita de una semana de edad, incapaz de levantarse después del nacimiento, el cual presentó quistes tisulares del parásito en el cerebro y médula espinal (Dubey et al., 1990). Una de las primeras investigaciones sobre la importancia del Neospora caninum en la reproducción en los ovinos fue la inoculación de taquizoítos del parásito en las ovejas con 65, 90 y 120 días de gestación, esto dio como resultado aborto espontáneos en las ovejas inoculadas al día 65 de gestación, pero las que fueron inoculadas a los 120 días de gestación, tuvieron crías que nacieron clínicamente normales (McAllister et al., 1998). Se detectó la presencia de Neospora caninum en fetos abortados de ovejas que fueron infectadas naturalmente, esto se demostró a través de la técnica PCR del cerebro en los fetos abortados (Howe et al., 2012). 9 1.4.1. Etiología El Neospora caninum es un protozoo intracelular obligado, que tiene como hospedadores definitivos al perro, coyote (Canis latrans), lobos (Canis lupus) y como hospedadores intermediarios a bovinos, ovinos, búfalos, ciervos y equinos (Dubey, 2003). Produce alteraciones neuromusculares en los perros y abortos o mortalidad neonatal en los bovinos (King et al., 2010; Dubey et al., 2011). La primera información sobre él se tuvo en 1984, en Noruega, donde se detectó una camada de perros con miositis y encefalomielitis, encontrando un parásito similar a Toxoplasma gondii en el sistema nervioso central y muscular, sin encontrarse anticuerpos contra el toxoplasma (Bjerkas et al., 1984). 1.4.2 Clasificación taxonómica Neospora caninum está clasificado dentro del phylum Aplicomplexa, clase Sporozoa, subclase Coccidia, orden Eucoccidia, suborden Eimeriina, familia Sarcocystidae y género Neospora (Dubey et al., 2003). Mediante el uso de microscopios electrónicos se reconocieron organelas características de ese phylum como micronemas, roptrias y gránulos densos (Dubey et al., 2002). El Neospora caninum es similar a toxoplasma gondi, y está relacionado taxonómicamente a otros protozoos formadores de quistes (Cordero et al., 2000). 1.4.3. Estadios parasitarios Son, por su reconocimiento en sus ciclos: esporozoítos, taquizoitos y bradizoitos. Estos dos últimos se encuentran en hospederos intermediarios y son asexuales del parásito, con localización intracelular; por otro lado, los esporozoitos se eliminan en las heces del perro (Dubey y Lindsay, 1996; Gondim et al., 2002). Los taquizoítos miden 3 a 7 m de largo por 1 a 5 m de ancho y tienen forma de media luna o globular, según la etapa de división en la que se encuentren (Dubey y Lindsay, 1996). Se ha encontrado taquizoítos en células renales, fibroblastos, 10 neuronas, hepatocitos, miositos, células endoteliales y macrófagos (Dubey et al., 2002). Los taquizoítos están compuestos por una película integrada por un plasmalema y un microporo, el cual contiene numerosos microtúbulos que recorren longitudinalmente la superficie interna de la membrana un complejo apical que consta de dos anillos apicales anteriores. También presenta un conoide, de hasta 150 micronemas y 8-18 rhoptries (Speer y Dubey, 1989). El taquizoíto invade la célula diana, dentro de la cual es “rodeado por una vacuola parasitófora cuya membrana se origina a partir de la superficie de la célula hospedadora y es modificada por el parásito poco después de la invasión. El taquizoíto secreta a su vez proteínas que originan una red tubular en el espacio intercelular dentro de la vacuola (Hemphill et al., 1998) e inicia su proceso de división por endodiogenia (Speer y Dubey, 1989)” (Risco 2008: 4-5). Los taquizoítos de crecimiento rápido son eliminados por la respuesta inmunitaria del huésped que impulsa el desarrollo hacia la etapa bradyzoite enquistadas dividiendose lentamente (Hemphill, 2006). Los bradizoítos tiene una replicación más lenta que los taquizoítos, llegando a medir aproximadamente “de 5 a 8 m de largo y de 1 a 2 m de ancho y poseen las mismas organelas que el taquizoíto […] (Dubey et al., 2004)”. A diferencia del taquizoíto, el bradizoíto presenta en su interior un “núcleo en posición subterminal, posee menos roptrias y más gránulos de amilopectina” (Risco 2008: 5). Los bradizoítos están contenidos en “quistes tisulares formados en el espacio intracitoplasmático de una sola célula” (Risco 2008: 5). Los quistes tisulares presentan forma redonda u oval y su tamaño puede variar desde 50 hasta 107 m. La pared quística presenta un grosor que oscila entre 2,5 a 4 m y está constituida por dos capas: una membrana citoplasmática externa lisa, proveniente de la vacuola parasitófora, y otra capa interna gruesa, conformada por numerosas vesículas y gránulos unidos a la membrana (Barr et al., 1991; Dubey et al., 2006). 11 Se ha observado quistes tisulares en el tejido nervioso y con menor frecuencia en tejido muscular esquelético (Dubey et al., 2002). El estadio infectante para los hospedadores intermediarios es el esporozoíto, localizándose dentro de los ooquistes esporulados. El ooquiste se forma tras la multiplicación sexual del parásito y representa la fase resistente en el medio ambiente (McAllister et al., 1998); presenta forma esférica o subesférica y mide aproximadamente 11,7 m de largo, 11,3 m de ancho y la pared presenta un grosor entre 0,6 y 0,8 m, los ooquistes contienen dos esporoquistes lo cual contiene a su vez cuatro esporozoítos cada uno, los esporozoitos tienen un tamaño aproximado de 6,5 m de largo por 2,0 m de ancho (McAllister et al., 1998; Lindsay et al., 1999). 1.4.4 Ciclo biológico El Neospora caninum tiene un ciclo de vida de dos fases: una sexual, en los hospedadores definitivos como el perro (McAllister et al., 1998) y coyote (Gondim et al., 2004), que además también pueden ser hospedadores intermediarios. Y la fase asexual, que se desarrolla en los hospederos intermediarios como bovinos, equinos, ovinos (Dubey y Lindsay, 1990), caprino (Barr et al., 1992) y ciervos (Gondim et al., 2004); con formación de taquizoítos y quistes tisulares conteniendo bradizoítos (Dubey y Lindsay, 1996). Los hospederos definitivos se infectan ingiriendo tejidos de hospedadores intermediarios que contengan el quiste tisular alojado en placentas y restos de fetos abortados (Dubey, 2003), conteniendo en su interior los bradizoítos. La ingesta de quistes tisulares es el único proceso que puede inducir a la excreción de ooquistes en los hospederos definitivos (Dubey y Lindsay, 1996; McAllister et al., 1998). Una vez ingeridos los quistes tisulares, “la pared del quiste es degradada por los jugos gástricos, liberando las formas parasitarias que inician los estados entero-epiteliales” (Girata 2016: 32), dándose la multiplicación sexual con la posterior formación de ooquistes no esporulados eliminados con las heces entre 12 8-14 días postinfección (McAllister et al., 1998) y por un periodo patente variable. Ya en el medio ambiente, el ooquiste inicia el proceso de esporulación en un transcurso de 24 a 72 horas donde se vuelven infectivos (McAllister et al., 1998; Dubey et al., 2004). Los hospederos intermediarios pueden infectarse por la ingesta de agua o alimentos contaminados con ooquistes, liberándose los esporozoítos a nivel del tracto gastrointestinal, atravesando la pared intestinal y accediendo a la circulación sanguínea o linfática, transformándose rápidamente en taquizoítos (Lindsay et al., 1999). Los taquizoítos son los responsables de la fase aguda de la infección. Penetran las células por invasión activa en un promedio de cinco minutos (Hemphill et al., 1996), en donde son englobados en una vacuola parasitófora, conformada por la célula hospedadora y el parásito, iniciando la multiplicación por endogamia en una gran variedad de células (Speer y Dubey, 1989) incluyendo miocitos, células neurales, macrófagos, hepatocitos, fibroblastos, neutrófilos y células endoteliales y renales (Dubey et al., 1988; Bjerkas y Presthus, 1989), donde una célula puede contener más de 100 taquizoítos (Gondin et al., 2002). A pesar de ser un parásito intracelular obligatorio, se puede encontrar en el espacio extracelular tras la ruptura de la célula hospedadora, para que dentro de pocas horas se dé inicio a los aparatos de adhesión e invasión a nuevas células dianas (Hemphill et al., 1996). La fase crónica se presenta cuando los taquizoítos se transforman en bradizoítos, con escasa o nula multiplicación en el interior de los quistes tisulares, esto se debe probablemente a los mecanismos de evasión de la respuesta inmunitaria del hospedador (Buxton et al., 1998; Buxton et al., 2002). Los quistes tisulares se pueden localizar, por lo general, en tejido nervioso, en infecciones naturales y experimentales (Peters et al., 2001; Dubey et al., 2002) y en tejido muscular (Dubey et al., 2004). Si durante la gestación de un hospedero intermediario, se da una primoinfección por ingesta de ooquistes esporulados o se reactiva una infección crónica de los 13 bradizoítos a taquizoítos, estos pueden llegar a la placenta por vía sanguínea e infectar al feto en desarrollo (Williams et al., 2009). 1.4.5 Epidemiología Prevalencia Son varios “los estudios de prevalencia de anticuerpos contra Neospora caninum [que] indican que la neosporosis presenta una amplia distribución mundial, encontrándose en Australia, Nueva Zelanda, Europa, China, Japón, África y América, siendo notificado en diferentes especies animales como bovinos, ovinos, búfalos de agua, equinos, caninos, camélidos, entre otros (Dubey et al., 2007)” (Jara 2009: 7). “Los valores de seroprevalencia obtenidos varían de acuerdo al país, región, técnica diagnóstica, punto de corte, tamaño de muestra seleccionado, características del muestreo, tipo de explotaciones con o sin antecedentes de sufrir pérdidas reproductivas” (Granados 2012: 18). Las prevalencias de Neospora caninum en ovinos, varia en muchos países como Inglaterra con 0,45% (Helmick et al., 2002), Nueva Zelanda con 0,63% (Reichel et al., 2008), Italia con 2% (Gaffuri et al., 2006), Australia con 2,2% (Bishop et al., 2010), Eslovaquia con 3,7% (Spilovská et al., 2009), España con 10,1% (Panadero et al., 2010), Suiza con 10,3% (Hässiget al., 2003), Brasil con 12% (Silva et al., 2011). En el Perú, hay varios estudios realizados sobre el Neospora caninum, siendo uno de ellos el realizado en el departamento de Junín encontrándose en llamas de la sociedad agrícola de interés social (SAIS) Pachacútec, con una seroprevalencia de 2,9% (Casas et al., 2006) y en ganado bovino de la SAIS Pachacútec una seroprevalencia de 13,2 % (Puray et al., 2006). Otros estudios realizados en el valle del Mantaro en bovinos lecheras encontraron seroprevalencia de 46,7% (Granados et al., 2014). 14 1.4.6. Transmisión En la actualidad se han descrito dos formas de transmisión del Neospora caninum, la vertical y horizontal, siendo la vertical la principal ruta de transmisión, eficiente y más frecuente en el ganado bovino (Dubey et al., 2003) Transmisión vertical La principal ruta de transmisión estudiada en bovinos es la placentaria, como ya se ha mencionado: eficiente y más frecuente: en una hembra gestante los taquizoítos atraviesan la placenta e invaden el feto, detectándose porcentajes de transmisión que van entre el 40% y el 95% (Dubey et al., 2007), con gran importancia en el mnatenimiento y propagación de la enfermedad en el hato, sin ser necesaria la dispersión de un hospedador definitivo (Schares et al., 1999). Las hembras congénitamente infectadas pueden transmitir la infección por varias gestaciones, sin embargo, la tasa de transmisión se va reduciendo con el tiempo por el desarrollo de inmunidad (Anderson et al., 1995). Un estudio en 1999 demostró la transmisión transplacentaria en fetos de ovejas con infección latente y encontraron que las lesiones histopatológicas presentes en los tejidos fetales, eran causados por Neospora caninum (Buxton et al., 2001). Otros estudios en ovinos, también han relatado la transmisión transplacentaria (Kobayashi et al., 2001; Hässig et al., 2003). La transmisión transplacentaria se da tanto en animales que han abortado como en aquellos que no han mostrado la patología abortiva (Dubey y Lindsay, 1996). Se ha manifestado en el ganado bovino, ovino (Dubey y Lindsay, 1990; McAllister et al., 1996; Buxton et al., 1998), caprino (Lindsay et al., 1995), y canino (Dubey et al., 1996). La transmisión transplacentaria puede ser endógena o exógena (Trees y Williams, 2005). La transmisión transplacentaria endógena se presenta en las hembras infectadas de manera crónica durante la gestación, esto se relaciona con un 15 modelo frecuente de abortos, siendo baja la tasa de aborto que se manifiesta a lo largo de meses y años (Schares et al., 2001). Por el contrario, la transmisión transplacentaria exógena se presenta en bovinos hembras gestantes que son infectadas por primera vez en este periodo mediante una transmisión horizontal; en este caso, la infección se transmite a la progenie, relacionada con abortos de patrón epidémico y tasas de aborto superiores al 10-12,5% en tiempos menores a 6 a 8 semanas (Dijkstra et al., 2001; Schares et al., 2005). Se ha demostrado de manera experimental que la transmisión vertical por vía calostro en el ganado bovino, durante el periodo neonatal, es posible (Uggla et al., 1998; Davison et al., 2001), pero no ha sido demostrado de manera natural. En ovinos, esta forma de transmisión también fue reportada (Silva et al., 2013) y causa abortos, mortalidad neonatal por partos prematuros, reabsorción embrionaria y nacimiento de crías con insuficiencias neuromusculares en bovinos y ovinos, con el lógico impacto negativo sobre el desenvolvimiento reproductivo de los hatos (Dubey, 2003). Transmisión horizontal La transmisión horizontal en los hospederos definitivos, se sabe que ocurre tras la ingesta de un quiste del hospedador intermediario que contiene bradizoítos, mayormente en tejido nervioso como cerebro y médula. Los bradizoítos contenidos en los quistes pueden conservar su capacidad infectante durante largos periodos de tiempo (Bergeron et al., 2001). Otra forma de transmisión natural se da por ingerir tejidos fetales abortados o placentas que presenten quistes tisulares de hospederos intermediarios (Dijkstra et al., 2002). La transmisión horizontal en los hospederos intermediarios puede ser directa, como la ingesta de ooquistes esporulados de Neospora caninum eliminados en las heces del perro o a través de pastos y/o agua contaminada con ooquiste (De 16 Marez et al., 1999; Trees et al., 2002). En los hatos se ha demostrado la eficiencia de la transmisión vertical, pero la infección no se mantendría a niveles constantes si no hubiera cierto nivel de transmisión horizontal postnatal (Davison et al., 1999). También se han descrito otras vías de transmisión en los hospederos intermediarios, aunque de baja transmisión natural, como la venérea, que puede ser posible, pero es incierta, en las vacas infectadas por experimentos de inoculación intrauterina a partir del semen contaminado con taquizoítos (Serrano et al., 2006). 1.4.7. Patogenia Los taquizoítos tienen la capacidad de poder invadir células de diversidad de tejidos. Expeimentalmente, pueden ingresar a la célula del hospedador a través de proteoglicanos de superficie (Neguleswaran et al., 2002), en un tiempo aproximado de 5 minutos y ubicándose en el citoplasma, en el interior de la vacuola parasitófora, dando inicio a la multiplicación por endogamia, pudiendo una célula albergar 100 parásitos (Pérez et al., 1999). La multiplicación activa resulta en la ruptura de la célula hospedadora y en la necrosis del tejido invadido. Esto genera una respuesta del huésped, una infiltración no purulenta aguda, que se encuentra alrededor del área de necrosis, este proceso con el tiempo genera la proliferación del tejido conectivo en la zona (Pérez et al., 1999). Según el tejido lesionado, lo cual puede ser nervioso, muscular o tejido placentario, se manifestarán los signos clínicos. En el sistema nervioso central (SNC), el parásito llega a invadir neuronas y astrocitos, llegando también afectar nervios craneales y espinales, generando la interrupción de la transmisión del impulso nervioso, teniendo como consecuencia trastornos neuromusculares (Pérez et al., 1999). En caninos que presentaron signos clínicos, se encontró al párasito en el SNC afectando en su mayoría al cerebro, los taquizoítos se encuentran en mayor frecuencia en la musculatura estriada esquelética y el corazón (Barber et al., 1996). Patogenia del aborto 17 La consecuencia más estudiada y de mayor importancia de la infección por Neospora caninum en los bovinos es el aborto o el nacimiento de terneros infectados congénitamente. Son varios los factores que contribuyen al progreso del aborto: el instante de la gestación en que se origina la parasitemia (Buxtom et al., 2002), “la magnitud y duración de la parasitemia, de la eficacia de la respuesta inmune maternal, [la capacidad del feto de poder generar una respuesta inmune] y de las características del aislado [de Neospora caninum] (…) (Innes et al., 2007)” (Collantes 2003: 32). En las hembras gestantes, los bradizoítos alojados en los quistes tisulares del SNC pueden volver a activarse si se dan ciertas condiciones hormonales e inmunológicas dando inicio a una parasitemia (Innes et al., 2002; Quinn et al., 2002). Iniciada la parasitemia, sea por reactivación de quistes latentes o como consecuencia de una infección externa (Williams et al., 2000), tras la ingesta de quistes esporulados, los esporozoitos se desprenden en el intestino delgado, llegando a parasitar el epitelio, transformándose en taquizoítos. Estos son los responsables de la fase aguda de la infección, dando paso a la etapa de multiplicación rápida en los linfonódulos mesentéricos y que posteriormente se liberan al torrente sanguíneo, alcanzando diferentes tejidos (Dubey et al., 2006). Los taquizoítos, al estar presentes en los tejidos, se multiplican intracelularmente por endodiogenia (Dubey y Lindsay, 1996). Cuando estos migran al epitelio uterino y atraviesan la placenta, generan vasculitis, trombosis y necrosis en el placentoma, llegando también por vía sanguínea al feto (Dubey, 2003). En la primera etapa de la gestación, la infección por Neospora caninum produce la muerte del feto, o su reabsorción, ya que su sistema inmune no está del todo desarrollado. Si la infección se presenta en el segundo tercio de la gestación, se producirá el aborto debido a que el feto tiene una respuesta inmune básica e insuficiente para prevalecer sobre la infección (Gonzales et al., 1999), o puede llegar al nacimiento generando terneros congénitamente infectados que pueden presentar sintomatología aparente. Cuando la infección se da en el tercio final de 18 la gestación nacerán terneros infectados, pero clínicamente sanos (Buxton et al., 2002). Estudios realizados tanto en infección natural (Bar et al., 1991) como en infecciones experimentales en bovinos (Barr et al., 1994; Williams et al., 2000, 2003), demuestran que la transmisión del parásito es menos probable al inicio de la gestación, y si se produce trae como consecuencia la muerte fetal seguida de una posterior reabsorción. La neosporosis en ovinos es menos relevante que en los bovinos. Sin embargo, en predios en los que se crían conjuntamente, los ovinos pueden, eventualmente, sufrir la epidemia de la infección (Vogel et al., 2006). 1.4.8. Inmunidad Inmunidad en la gestación Durante la gestación, se mantienen altos los niveles de progesterona y se da una respuesta inmune Th2 (mediada por linfocitos helper tipo 2), lo cual mantiene la gestación a través de la producción de IL4 (interleuquina 4), IL-5, IL-6, IL-9 e IL-10 y una reducción de moléculas pro-inflamatorias como IL-12 e IFN-ɣ (interferóngamma), ya que estas son perjudiciales en la gestación (Clark et al., 1999). El rechazo del feto se puede dar por un desbalance entre la respuesta entre Th1 y Th2, en donde Th1 favorece la producción IFN-ɣ y otras citoquinas asociadas a este tipo de respuesta (Granados 2012) como “[l]as interleuquinas IL- 2, IL-3 y IL-12, [que] promueven actividades citolíticas en macrófagos y NK (natural killer), activan la protrombina facilitando la coagulación y la trombosis y estimulan la producción de inmunoglobulinas que activan la cascada del complemento. [Procesos patológicos] que promueven una respuesta TH1 alteran el sincitiotrofoblasto. Más aún, el INF-ɣ es capaz de actuar directamente sobre este tejido, induciendo abortos espontáneos (Moore et al., 2005)” (Granados 2012: 30). 19 Inmunidad en las infecciones por Neospora Caninum La respuesta inmunológica frente a Neospora caninum se da en los primeros momentos tras la infección. Siendo la primera respuesta la inmunidad innata, la cual es llevada por las células dendríticas, células natural killer y macrófagos, las cuales responderán liberando citoquinas de tipo IL-12 e INF-γ (Boysen et al., 2006; Strohbusch et al., 2009). “[R]esulta de interés el papel del óxido nítrico (ON), producido por macrófagos activados, que tiene diversas funciones entre las cuales se mencionan la inmunosupresión y la destrucción de parásitos intracelulares, observando que ratones deficientes en óxido nítrico sintetasa, enzima que produce ON, son susceptibles a Neospora caninum (Tizard, 2009; Tanaka et al., 2000)” (Jara, 2009: 18-19). Las infecciones parasitarias generan diferentes tipos de respuesta inmune de tipo celular según el tipo de parásito, los parásitos extracelulares inducen una respuesta del tipo Th2 produciendo IL-4, IL-5, IL6, IL-9, IL-10, IL-13, IgG1, e IgE; en cambio los parásitos intracelulares estimulan una respuesta inmune del tipo Th1 donde predomina la producción de IL-12, INF-γ, TNF (Factor de necrosis tumoral) e IgG2 (Tizard, 2009). En las infecciones naturales y experimentales de animales a partir de los taquizoítos u ooquistes de Neospora caninum, la respuesta de la IgG se inclina a incrementar con el curso de la infección, lo que permite identificar animales crónicos o recientemente infectados (Baszlert et al., 1999). Neospora caninum estimula una respuesta inmune Th1, la cual es mediada por IL- 12, con la producción de INF-γ, IL-2, TNF-α “y la presencia de células NK también productoras de INF-γ. Estos linfocitos Th1 son activados por epítopes expresados en la superficie de las células presentadoras de antígenos (macrófagos, células dendríticas), asociados a moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) clase II, promoviendo la respuesta citolítica y la inmunidad celular mediada por anticuerpos; asimismo, cuando las proteínas antigénicas se procesan en el 20 interior de las células, los epítopes también son presentados a los linfocitos citotóxicos (Lc) asociados a moléculas de CMH-1 (Hemphill et al., 2006)” (Jara, 2009: 18). La importancia del IFN-γ se ha puesto en manifiesto en varios estudios in vitro e in vivo, en los cuales se demostró el papel importante en el control de la infección por N. caninum, mediante el tratamiento de fibroblastos con INF-γ recombinante, lo que causó “una significativa inhibición de la multiplicación intracelular de N. caninum, además, se comprobó un aumento de INF-γ después de la infección experimental en bovinos, asimismo, el cultivo de células de cerebro bovino, que es altamente susceptible a la infección por Neospora caninum, puede ser inhibida por adicción de IFN-γ y FNT (Innes et al., 1995; Yamane et al., 2000)” (Jara, 2009: 18). Ha quedado demostrada la intervención de los linfocitos CD4+ y CD8+ en la producción de IFN-γ en los primeros estadios de la infección, mientras que solo los CD4+ prevalecen en las etapas más avanzadas (Marks et al., 1998; Tuo et al., 2005; Klevar et al., 2007), siendo las células T CD4+ posibles mediadoras de la lisis inmediata de células enfermas (Staska et al., 2003). En las primeras fases de la infección, el IFN-γ activa las células T CD4+ direccionando la réplica inmunitaria hacia un tipo Th1, a la vez activando los linfocitos T CD8+. Este último desempeña un rol vital durante la fase aguda, ya que actúa como células citotóxicas, frenando la propagación del parásito (Ritter et al., 2002; Spencer et al., 2005). En cambio, en etapas más avanzadas, los linfocitos T CD4+ tienen más importancia en la protección frente a Neospora caninum. En un estudio con ratones infectados con Neospora caninum, se les dio un tratamiento con anticuerpos monoclonales anti CD4+, los cuales presentaron una alta morbilidad y mortalidad; en cambio, los que fueron tratados con anti- CD8+, solo tuvieron una mortalidad del 30% (Tanaka et al., 2000; Nishikawa et al., 2001). 21 1.4.9. Signos clínicos Signos clínicos en los perros La neosporosis clínica en perros se puede presentar desde los 2 primeros días de vida (Barber et al., 1996), las manifestaciones clínicas de déficit neurológico y las alteraciones musculares son los que más predominan (Cornejo 2004). En los cachorros infectados congénitamente, se puede observar las manifestaciones más graves, por lo general animales menores de 6 meses de edad; observándose parálisis ascendente de los miembros con atrofia y rigidez muscular gradual (Dubey y Lappin., 2000). Signos clínicos en ovinos y otras especies El aborto en el bovino se puede presentar “entre el 3º y el 9º mes de gestación, pero es más frecuente entre los 4-6 meses (Lindsay et al., 1996). No se detectan signos clínicos previos al aborto. Los fetos generalmente se presentan autolíticos y en ocasiones con grados variables de momificación (Bildfel et al., 1994)” (Cornejo, 2004: 23); en cambio, aquellos fetos que mueren antes del 5to mes de gestación pueden momificarse y quedar retenidos en el útero hasta el término de la gestación (Pérez et al., 1999). Por el contrario, si la muerte ocurre en los primeros meses de gestación, se puede dar la reabsorción seguida por un nuevo celo (Barr et al., 1991; Dubey, 2003). Los animales que nacen vivos, manifiestan los primeros signos clínicos, frecuentemente, a los 4 o 5 días de postparto y hasta 2 semanas (Dubey y Lahunta, 1993; Duivenvoorden y Lusis, 1995). Al examen neurológico puede observarse disminución del reflejo patelar y de la propiocepción (Dubey et al., 2006), también puede producir defectos congénitos como escoliosis, hidrocefalia o estrechamiento del cordón espinal (Barr et al., 1991; Dubey y Lindsay, 1996). En ovinos se demostró de forma experimental un caso de neosporosis congénita, en el cual el cordero “nació débil, parcialmente atáxico, y murió a la semana de 22 edad (Dubey y Lindsay, 1990)” (Jara, 2009: 21). En un estudio con ovejas gestantes, se observó la presencia de aborto, fetos momificados, nacidos muertos, nacimiento de crías débiles y el nacimiento de los cachorros clínicamente sanos, pero con infección congénita (McAllister et al., 1996). En otro trabajo experimental, se demostró la ocurrencia de muerte y reabsorción del embrión, y otras fallas reproductivas, según la edad gestacional en la que se infectaron las ovejas (McAllister et al, 1996). 1.4.10. Lesiones La infección natural o experimental de ovejas con taquizoítos de N. caninum tiene cambios patológicos y clínicos similares a las observadas en el ganado bovino (Dubey y Lindsay, 1990). Las lesiones causadas por el Neospora caninum son la “muerte celular acompañada por lesiones necróticas visibles en varios días, debido a una activa replicación de los taquizoítos, provocando daños en la conductividad nerviosa-muscular, causado por la destrucción de las células nerviosas, así como daño cerebral y de la médula espinal (Georgieva et al., 2006)” (Jara, 2009: 21-22). En 1996, en un trabajo con ovejas infectadas experimentalmente se encontraron lesiones histopatológicas como encefalitis multifocal no supurativa, miositis no supurativa, además de placentitis necrotizante no supurativa. Los quistes también fueron encontrados en el SNC de los fetos (McAllister et al., 1996). Otro estudio, un año después, encontró lesiones semejantes a las de estudios previos realizados por histopatología e IHC (Buxton et al., 1997). También se describió lesiones en los cotiledones de la placenta, corazón, pulmón e hígado (Buxton et al., 1998). En el 2003, se realizó un estudio en ovejas con infección experimental, donde se utilizaron cinco ovejas gestantes de diferentes días de gestación, los corderos a los que se les hizo la necropsia, nacidos de ovejas inoculadas, presentaron alteraciones histopatológicas en el sistema nervioso central, cuya característica era la existencia de formas quísticas del parásito asociado con infiltrado 23 inflamatorio de tipo mononuclear, áreas de necrosis y, en menor medida, calcificación (Oviedo et al., 2003). Exámenes histopatológicos reportaron, encefalitis multifocal, nódulos gliales, células mononucleares, inflamatorias y quistes tisulares con numerosos bradizoítos en el cerebro de una oveja preñada asintomática y en el cerebro de los dos fetos, confirmado por IHC (Kobayashi et al., 2001). También se informó, por medio de IHC, de la presencia de quistes de Neospora caninum y de lesiones en el cerebro de fetos abortados (Hássig et al., 2003). Un estudio en una población de ovejas con problemas de aborto en Nueva Zelanda, a través del examen histopatológico, dio a conocer la mineralización multifocal del estroma, como también necrosis e infiltración de neutrófilos en la base de la carúncula materna; los placentomas maternos tenían mineralización granular crónica con pequeñas áreas de necrosis multifocal del epitelio coriónico y maternal, pero ningún quiste de protozoarios se observó en el cerebro del feto, pero a los animales se les realizó ELISA y PCR, lo cual confirmó la infección por N. caninum (Howe et al., 2008). 1.4.11. Diagnóstico “El diagnóstico de la neosporosis canina y ovina requiere de un procedimiento de recolección de información, que empieza con los datos de anamnesis, epidemiologia y la observación de signos clínicos y lesiones, [dando] un diagnóstico presuntivo, que debe ser confirmado por exámenes especializados (…) (Dubey, 2003)” (Cornejo, 2004: 27). Son numerosas las técnicas confiables para investigar la infección por N. caninum en casos de aborto bovino, pudiendo ser obtenido principalmente examinando fetos abortados y complementariamente por análisis de anticuerpos del parásito en las madres y sus crías. Para confirmar la situación en un rodeo con relación a abortos debidos a N. caninum es necesario aplicar una combinación de técnicas de diagnóstico (Ortega-Mora et al., 2007). 24 Pruebas serológicas Inmunofluorescencia indirecta (IFI) “[IFI] fue el primer test aplicado a la detección de anticuerpos contra N. caninum (…) y es considerada la técnica estándar a comparación de otras (Dubey y Lindsay, 1996)” (Fort, 2003: 8). La prueba de IFI utiliza taquizoítos intactos como antígenos detectando principalmente anticuerpos dirigidos contra antígenos presentes sobre la superficie del parásito (Bjórkman et al., 1999), teniendo muy poca reacción cruzada con otros tipos protozoos como sarcocystis spp (Dubey et al., 1996). “La IFI sirve para detectar anticuerpos en el suero de un ternero sin mamar calostro, o en el líquido de cavidades de un feto abortado, indicando la infección por N. caninum (Barr et al., 1995), no necesariamente probando que el aborto fue ocasionado por N. caninum (Paré et al., 1996)” (Rodríguez, 2015: 26). Enzimoinmunoensayo (ELISA) “El ELISA ha sido ampliamente utilizado en el serodiagnóstico de la neosporosis. [Tiene] la facilidad para procesar un gran número de muestras, una sensibilidad y especificidad superiores a las obtenidas con la IF, sumado a la falta de subjetividad cuando se emite un resultado, hacen confiable esta prueba (Paré et al., 1997). (…) El valor de absorbancia asignado a una prueba es motivo de controversia ya que depende de factores tales como composición del antígeno, anticuerpos identificados y de los conjugados utilizados (Dubey et al., 1997). Un determinado (…) valor de corte debería ajustarse a cada circunstancia o situación epidemiológica (Dubey et al., 1999)” (Rodríguez, 2015: 26). ELISA indirecto 25 Es el tipo de ELISA más utilizado, “el cual emplea antígeno soluble de taquizoíto, mezcla de antígenos intracelulares y de membrana de los diferentes aislados de N. caninum BPA1 Y NC-1; puede ser usado con muestra de suero, leche y líquidos fetales para la detección de anticuerpos, además, los resultados pueden ser expresados como valores de densidad óptica (OD), valores porcentuales de positividad (PP), o valores de cociente entre muestra/controlpositivo (S/P) (Ortega et al., 2006)” (Granados, 2012: 41). ELISA de avidez Este ELISA es una modificación del ELISA indirecto, que permite analizar la avidez de IgG, esta “prueba de avidez está basada en el hecho de que el agregado de úrea durante el desarrollo del ELISA disocia las uniones débiles de los anticuerpos, mientras que los anticuerpos con alta avidez permanecen firmemente acoplados al antígeno, (…) permite distinguir infecciones primarias o recientes (…) de las infecciones preexistentes”. (Rodríguez, 2015: 27). Inmunoblot (IB) También llamado electrotransferencia, “es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada. (…) Como el IB, combina la resolución de la electroforesis en gel con la especificidad de detección inmunoquímica; el método tiene una alta especificidad. (…) Sin embargo, el inmunoblot no es utilizado como método habitual de diagnóstico sino como técnica confirmatoria de otras pruebas serológicas (Atkinson et al., 2000; Sóndgen et al., 2001)” (Rodrígez, 2015: 27-28), por lo tanto, es usado junto a otros test. Prueba de aglutinación “Esta prueba es muy útil porque no requiere de anticuerpos secundarios conjugados” (Rodríguez, 2015: 28) y se usan taquizoítos como antígeno; también es utilizada para el diagnóstico de neosporosis. Packham y colaboradores “desarrollaron un test de aglutinación, el cual fue comparado con IFI y ELISA. 26 Muestras de sueros procedentes de 16 especies diferentes de animales cuyos diagnósticos habían sido confirmados histopatológicamente fueron testeadas. La prueba de aglutinación dio una mayor sensibilidad (100%) y especificidad (97%) que la prueba de ELISA (74 y 95 %, respectivamente), y tuvo una mayor sensibilidad pero menor especificidad que la IFI (98 y 99%, respectivamente)” (Rodríguez, 2015: 28). Reacción en cadena de polimerasa (PCR) “Las técnicas de PCR es útil para detectar el parásito en los tejidos de fetos abortados. Las ventajas de esta técnica son su elevada especificidad y sensibilidad y la capacidad de amplificar pequeñas cantidades de ADN de Neospora caninum en una gran variedad de tejidos” (Granillo y Martínez 2008: 45). 1.4.12. Tratamiento El tratamiento farmacológico de la neosporosis bovina no es posible actualmente por la falta de fármacos eficaces y rentables (Dubey et al., 2011). Para el tratamiento en caninos como en bovinos “se ha recomendado una terapéutica similar a la utilizada en los casos de toxoplasmosis (T. gondii), la cual consiste en el uso de clindamicina oral en dosis de 12,5 a 18,5 mg/kg/p.v. suministrada dos veces por día durante un período de 2 a 4 semanas” (Granillo y Martínez 2008: 49). Al igual, resulta eficaz la asociación “de pirimetamina y sulfonamidas vía oral a dosis de 0,25 a 0,5 y 30 mg/kg/p.v., respectivamente, cada 12 horas por 4 semanas (Cuéllar et al., 2004)” (Granillo y Martínez 2008: 49). En un estudio experimental en terneros con neosporosis se utilizó toltrazuril y ponazuril, derivados de la droga triazinona, utilizada para el tratamiento de coccidiosis, teniendo como resultados la disminución de las lesiones cerebrales causadas por la enfermedad (Moore et al., 2005). 27 1.4.13. Control Por lo general, “la neosporosis se presenta como una causa más de aborto [en el ganado] y el control debe ir encaminado, fundamentalmente, a reducir la prevalencia de la infección [en los hatos] con brotes declarados y prevenir su propagación (…) evitando tanto la transmisión horizontal como la vertical” (Collantes, 2003: 67). Una de las medidas de control es disminuir la infección postnatal tratando de reducir “el riesgo de infección con la ingestión de ooquistes eliminados en las heces del hospedero definitivo, restringiendo el acceso de los perros a las fuentes de agua, pasturas, galpones y silos donde se almacene alimento para los bovinos” (Jara, 2009: 27); también, eliminar los fetos abortados y las placentas evitando de esa manera el foco infeccioso hacia los perros (McAlliester et al., 1998; Moore et al., 2001). En el caso del control de la transmisión congénita en un hato, las medidas recomendadas son la identificación de los animales seropositivos, si la serología indica una alta prevalencia del parásito se podría mantener en el hato los animales infectados, pero estos deben estar separados del resto de los animales así como las crías de estos; realizar exámenes antes de la ingesta de calostro; en caso estas crías nazcan sin infección, deberán ser alimentadas con calostro de madres seronegativas y estas crías pueden permanecer en el hato para ser utilizadas como recría. En caso con el control del hato con prevalencia baja, se podría realizar la eliminación de los animales infectados o realizar una separación progresiva de los animales (Thurmond y Hietala, 1995). 1.4.14. Prevención Vacunación Una “medida eficaz de la prevención de la transmisión vertical (…) podría ser la inmunoprofilaxis. (…) recientemente se ha descrito una vacuna frente a N. caninum que ha tenido escaso éxito (Andrianarivo et al., 2000)” (Álvarez, 2003: 84). 28 “Las pérdidas reproductivas pueden presentarse más de una vez en gestaciones subsiguientes, [sin embargo] las tasas de repetición de aborto por neosporosis son relativamente bajas (menores al 5 %) (Anderson et al., 1991; Wouda et al 1998)” (Contreras, 2011: 36). En estudios experimentales se ha demostrado la importancia de “inducir una respuesta inmune eficaz de tipo Th1 (…). Sin embargo, una fuerte respuesta tipo Th1 originada como consecuencia de una vacunación podría ser incompatible con el desarrollo de una gestación normal” (Álvarez, 2003: 84). “[U]na vacuna inactivada (NeoGuar, Intervet) estuvo aprobada para su uso en vacas gestantes en los Estados Unidos hasta el año 2009. A pesar de ser una vacuna segura, su papel protector frente al aborto fue muy discutido, ya que esta vacuna no confería protección en vacas gestantes infectadas experimentalmente con el parásito (Andrianarivo et al., 2000), y en varios estudios de campo presentó una eficacia variable (5,2%-54%) (Heuer et al., 2003; Romero et al., 2004; Weston et al., 20011)” (Rojo, 2012: 22). Estudios experimentales realizados con ganado bovino demostraron que el uso de vacunas vivas atenuadas generó protección frente a aborto. “[T]ambién se están dirigiendo [investigaciones] hacia el diseño de vacunas de nueva generación empleando diversos antígenos recombinantes, parásitos transgénicos o nuevas técnicas de adyuvantación (Innes et al., 2011)” (Rojo, 2012: 22). 29 III. MATERIALES Y MÉTODOS Localización y ambiente El presente estudio se desarrolló en la unidad de producción de Cochas de la SAIS Túpac Amaru, situado a una altura de 4500 m s.n.m. en el distrito de Canchayllo, provincia de Jauja, departamento de Junín, a la altura del km 43 de la carretera central La Oroya-Huancayo. a. Población y muestra La población total de ovinos en la SAIS Túpac Amaru es de 81,533 (Informe anual de la SAIS Túpac Amaru), los cuales son manejados en rebaños diferentes según la calidad genética, clasificándolos como de mayor calidad genética hasta una menor calidad genética. El tamaño de muestra se determinó a una proporción de 13,2% a referencia de esta prevalencia en el área estudiada (Puray et al., 2006). Para lo cual, se utilizó el método de tamaño mínimo muestral para una población conocida, la cual dio como resultado 176 con un nivel de confianza del 95% y un error aceptado de 5%; tamaño mínimo de muestra para proporciones en una población finita (Bejarano et al., 2006). n= NZ 2 pq e2(N-1)+ Z2pq Donde: n: tamaño de muestra N: estimación de números de animales en la población Z: nivel de confienza del 95% (1,96) p: Prevalencia referencial (Puray et al., 2006). 30 q: 1-p e: error máximo admisible 5% n= (81533) (1,96)2 (0,132 ) (1- 0,132 ) (81533-1) (0,05)2 + (1,96)2 (0,132) (1- 0,132) n= 176 Este estudio trabajará con 367 animales por disponer de mayor número de muestras y materiales, para poder así obtener mayor confianza en el resultado. b. Diseño experimental Este estudio es descriptivo transversal y fue muestreo aleatorio de los ovinos raza Junín teniendo en cuenta la edad y el sexo del animal, de los que se eligió al azar (tabla de números aleatorios) para ser analizados, teniendo un resultado de 367 animales, los cuales fueron rotulados con la identificación, edad, sexo y categoría genética en un registro. c. Diseños metodológicos i. Toma de muestra Se colectó muestras sanguíneas de los animales, estos fueron manipulados según las técnicas de manejo y sujeción para ovinos, realizándose la recolección de las pruebas por venopunción yugular en un tubo Vacutainer de 5 ml sin anticoagulante, se centrifugó a 2500rpm x 5 minutos, se aisló el suero y conservo a -20°C, hasta su procesamiento, los cuales forman parte del banco de sueros del Laboratorio de Microbiología de la Universidad Científica del Sur. ii. Procesamiento de muestras Se empleó la técnica de ELISA indirecto mediante VMRD Neospora caninum 31 Antibody test kit, cELISA, con una sensibilidad de 97,6% y especificidad del 98,6%, para detección de anticuerpos, el cual contiene un conjugado antibovino (Baszler et al., 2001). Se preparó los controles positivos y negativos, se cargó el control positivo y negativo por duplicado y las muestras se utilizaron sin diluirse. Se preparó las placas y se retiró de la bolsa de aluminio. Se preparó 1X conjugado anticuerpo- peroxidasa mediante la dilución de 1 parte del conjugado anticuerpo-peroxidasa 100X (D) con 99 partes de tampón de dilución conjugado (E). La solución 1X de lavado se preparó diluyendo la solución de lavado 10X de concentrado con 9 partes de agua destilada o desionizada. Se necesitaron aproximadamente 1,5 ml por pocillo. Se inició el procesamiento, calibrando una micropipeta a 50 μl, se cargó los controles y las muestras de suero en cada pocillo de la placa que estaba recubierta de antígenos (A) lo más rápido posible. Se cubrió la parte superior de la placa y se incubó la placa por 1 hora a temperatura ambiente (23 ±2C). Después de 1 hora de incubación se lavó las placas 3 veces, se procedió a voltear y retirar el suero y los controles restantes golpeando fuertemente la placa invertida 4 veces en papel toalla limpia. Inmediatamente se llenó cada pocillo con la solución de lavado utilizando un dispositivo de llenado multicanal, luego se retiró la solución y este procedimiento se repitió2 veces adicionales, dando un total de 3 lavados. Se añadió 50 μl del diluido (1X) conjugado de Antibody-peroxidasa a cada pocillo. Se incubó durante 20 minutos adicionales a temperatura ambiente (23±2°C). Después de incubar por 20 minutos se procedió con 3 lavados de la misma forma que se mencionó anteriormente. 32 Luego se añadió 50 μl de la solución sustrato (G) en cada pocillo, se tiene que realizar pequeños golpecitos para asegurar que la capa de sustrato se encuentre en el fondo del pocillo. Se incubó por 20 minutos a temperatura ambiente (23±2°C) evitando la luz solar. Se añadió 50 μl de la solución Stop (H) a cada pocillo y se dio un pequeño golpecito para asegurar la mezcla de la solución de sustrato y la solución de Stop. Inmediatamente después de añadir la solución Stop, la placa se leyó en un espectrofotómetro de absorbancia de microplacas. Finalmente, se ajustó la densidad óptica (DO) de longitud de onda de lectura de 650 nm en blanco para poder leerlo (Baszler et al., 2001). Interpretación Para la presentación del resultado se utilizó el cociente (%I): %I = 100 [1-(muestra D.O / NC O.D)] Para lo cual primero se realizará el cálculo del porcentaje de inhibición, luego se realizará el test de validación de los controles donde la media del control negativo D.O debe ser ≥ 0,30 y < 2,50, y la media del control positivo D.O debe ser ≥30% de inhibición. Si la muestra de ensayo produce una inhibición de la aglutinación (antígeno- anticuerpo)> 30%, es positivo; y si la muestra problema es <30% de inhibición, será considerado negativo, según el manual de procedimientos del kit comercial en mención. Análisis de datos Los resultados obtenidos serán presentados en tablas de frecuencia y expresados en porcentaje, con sus respectivos intervalos de confianza, lo que nos permitirá la determinación de prevalencias mínimas y máximas, vinculadas a las variables 33 evaluadas. Se determinará la asociación estadística (p<0,05) entre la positividad a anticuerpos contra Neospora caninum, frente a las variables sexo, y edad. Se utilizó la simulación Beta PERT de distribución estocástica con el programa para análisis de riesgo @Risk 5.5® (100 interacciones), con el fin de obtener una curva de distribución de la proporción de resultados positivos a Neospora caninum. 34 IV. RESULTADOS Se evaluaron 367 muestras sanguíneas de ovinos (Ovis aries) recolectadas de la Unidad de Producción de Cochas de la SAIS Túpac Amaru en Junín – Perú. Se determinó la prevalencia de 0,82% (3/367) con un IC95%: 0% - 1,74% de animales seropositivos a anticuerpos contra Neospora caninum (Cuadro1). El resultado obtenido fue de 1,1% (3/367) de ovinas hembras para variable sexo; el porcentaje de suero positivo de 4 años de edad fue de 2,1% (3/367); En relación a la variable calidad genética se obtuvo para la categoría A: 1,1% (1/367), categoría B: 1,7% (2/367); sin que para ninguno se haya determinado una asociación estadística (p> 0,05) (Cuadro 1). Cuadro 1. Determinación de seropositivos contra Neospora caninum según sexo, edad y clase en ovinos de la SAIS Túpac Amaru (n=367) Positivos Total Porcentaje Min Max Valor p Macho 0 91 0,0% 0,00% 0,00% Sexo 0,318 Hembra 3 276 1,1% 0,00% 2,31% 2 años 0 37 0,0% 0,00% 0,00% Edad 3 años 0 184 0,0% 0,00% 0,00% 0,101 4 años 3 146 2,1% 0,00% 4,36% TOTAL 3 367 0,8% 0,00% 1,74% Gráfico 1. Curva de distribución beta pert para la proporción de Neospora caninum en ovinos de la SAIS Túpac Amaru. Mediante el programa de análisis de riesgo @Risk 5.5® 35 Se realizaron 100 interacciones, para establecer la prevalencia mínima y máxima de 0,7620% y 0,8780%, respectivamente (n=367). Pert (0,738,0,82,0,0902) Minimun 0,7380 Maximun 0,9020 Mean 0,8200 Std Dev 0,0310 36 V. DISCUSIÓN El resultado del presente estudio evidenció la presencia de ovinos positivos a anticuerpos contra Neospora caninum en un 0,82% (3/367) de las muestras evaluadas. Estudios previos, reportan prevalencias de anticuerpos contra Neospora caninum con una amplia distribución a nivel mundial, afectando diferentes especies animales como bovinos, llamas, alpacas y ovinos con índices entre 2,6 % y 68,7% (Chávez et al., 2002; Dubey et al., 2007; Granados et al., 2014). Sobre la neosporosis, existen diferentes estudios que evidencian la existencia de anticuerpos contra el parásito en ovinos, siendo la prevalencia obtenida en este estudio (0,82%) menor a la reportada en Italia con 2% con la técnica ELISA (Gaffuri et al., 2006), en el sur de Brasil con 3,2 % usando la técnica ELISA (Vogel et al., 2006), en el estado de Paraná con 9,5% (Romanelli et al., 2007) a través de la técnica IFI, en Suiza con 10,3% con la técnica IFI (Hássig et al., 2003) y también en Pakistán 27,7% con la técnica ELISA (Nasir et al., 2012). Por lo que al existir reportes de anticuerpos contra Neospora caninum en ovinos de varias partes del mundo, se hacen necesarios estudios en el país que permitan evidenciar una prevalencia oficial de esta enfermedad, como herramienta para la toma de decisiones de programas de prevención y control en las regiones y a nivel nacional. A nivel nacional, se ha detectado la presencia de anticuerpos contra N. caninum en la sierra central del Perú (2002), obteniéndose 18.4% en alpacas y llamas, siendo este el primer reporte para estas especies (Chávez et al.,2002); también se obtuvo (2.9%) en llamas hembras dela SAIS Pachacútec, caracterizada por ser un sistema de crianza extensiva pero separado por especies; siendo este último, más bajo que el anterior estudio(Casas et al., 2006); Otro estudio reportó 13.2% de positivos, realizado también en ganado de la SAIS Pachacútec (Puray et al.,2006), y finalmente un último reporte obtuvo 46,7% en bovinos lecheros en el valle del Mantaro (Granados et al., 2014). La baja prevalencia reportada en el presente 37 estudio, puede deberse a la baja exposición de pastos, forrajes y agua contaminados por los ooquistes infectivos; el tiempo de sobrevida de los ooquistes en el medio ambiente, aunque esto no se conoce con exactitud. Asimismo, se supone que poseen similar resistencia a los de T. gondii (Dubey et al., 2004), pero se sabe que las bajas temperaturas y la humedad favorecen la esporulación y la supervivencia de estos ooquistes (Dubey et al., 2007). Presumir Para la detección de anticuerpos contra Neospora caninum se usa la técnica de inmunoflorecencia indirecta (IFI) y ELISA; la IFI es considerada la técnica estándar, pero la prueba de ELISA utilizada en el presente estudio, es recomendada sobre todo para estudios epidemiológicos porque permite su aplicación en un gran número de muestras con una sensibilidad del 97,6% y una especificidad del 98,6%; y no son dependientes de la subjetividad en la interpretación, como sucede con el IFI (Baszler et al., 2001; Ahmad et al., 2011). Además, varios estudios determinaron una concordancia (0,98%) casi absoluta descrito por la índice kappa entre las técnicas IFI y ELISA (Serrano et al., 2018). Por lo que, estas pruebas podrían utilizarse indistintamente para el diagnóstico de la infección por Neospora caninum. La prevalencia obtenida en este estudio 0,82% (3/367) es más baja que la obtenida en Australia con 2,2% (5/232) (Bishop et al., 2010), en el norte de España 10,1% (18/177) (Panadero et al., 2010) y también menor a la obtenida en República Checa 11,5% (63/547) (Bartová et al., 2009), todos estos estudios fueron realizados en ovinos con la prueba VMRDs N. caninum cELISA antibovino, que demuestra ser una prueba confiable. El presente estudio no encontró una asociación significativa (p>0,05) entre la seropositividad y la edad o sexo de los animales, similar a reportes de otros estudios (Figliuolo et al., 2004; Romanelli et al., 2007; Spilovská et al., 2009), indicando la presencia homogénea del agente en el rebaño, esto puede sugerir que la transmisión vertical es posible; como datos experimentales y de campo, se ha demostrado una transmisión vertical del Neospora caninum en ovinos (Gonzales et al., 2014; Hássig et al., 2003; Jolley et al., 1999). En la transmisión 38 horizontal los perros son epidemiológicamente importantes (Dubey et al., 2007), también existe evidencia de una relación entre la infección de este protozoario en perros y ganado (Wouda et al., 2000); Además, se sabe que la transmisión horizontal en ovinos por la ingesta del ooquiste esporulado en alimentos contaminados con heces de perro, no es una ruta principal (Hássig et al., 2003). En el Perú, se reportan variadas prevalencias de N. caninum en bovinos, como el 57% de 104 muestras evaluadas en Arequipa (Andresen,1999); en Lima 29,6% en 304 muestras (Silva et al., 2002); en Cajamarca 45,95% en 74 muestras (Escurra, 2003); Junín 12,8% de 347 muestras y 46,7% de 182 muestras (Puray, 2006; Granados et al., 2014). En ovinos, para nuestro país, es necesaria la detección de anticuerpos anti-Neospora caninum, en distintas regiones para diagnosticar este parásito en otras explotaciones ovinas; además, se deben tomar las medidas necesarias para evitar la infección, ya sea controlando la población de caninos (hospederos definitivos) (Granados et al., 2011), mejorando la eliminación de restos de origen reproductivo (placenta, fetos abortados, secreciones, entre otros) y evitando la contaminación del alimento con quistes de tejidos u ooquistes esporulados como formas infectivas de la parasitosis en estudio (Bergeron et al., 2001). 39 VI. CONCLUSIONES Existe presencia de anticuerpos contra Neospora caninum en ovinos de la SAIS Túpac Amaru con una prevalencia de 0,82% (3/367). Estadísticamente no es significativa la asociación entre la presencia de anticuerpos contra Neospora caninum y el sexo o edad. 40 VII. RECOMENDACIONES Se recomienda que se realicen más estudios que asocien la presencia de la infección, en diferentes regiones del país, con el fin de detectar este parásito en explotaciones ovinas. Asimismo, determinar los factores de riesgo para cada tipo de crianza ovina en las diferentes condiciones ambientales y altitudinales. 41 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abo-Shehada N., Abu-Halaweh M. Flock-level seroprevalence of, and risk factors for, Neospora caninum among sheep and goats in northern Jordan. Prev Vet Med. 2010; 93(1): 25-32. Ahmad N., Jozani J., Neda Z. Adaptation of Dot-Elisa for Serodiagnosis of Neospora caninum Infestation in Aborted Cows. Global Veterinaria 2011; 7(2):149-152. Álvarez García G. 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