Facultad de Ciencias de la Salud Carrera Profesional de Nutrición y Dietética Compuestos Bioactivos y Capacidad Antioxidante de extractos de hoja de Sacha Culantro (Eryngium foetidum L.) y de Aceite de Copaiba (Copaifera paupera) procedentes de la Provincia de Coronel Portillo, Ucayali. Tesis para optar el título profesional de Licenciado en Nutrición y Dietética Presentado por: Bach. SILVIO LUIS PUENTE VIGO LIMA – PERÚ 2019 1 2 DEDICATORIA Dedico esta tesis principalmente a ser mis padres José Luis Puente Sánchez y Aurea Luz Vigo de Puente por su gran esfuerzo de brindarme una educación de primer nivel, por ser siempre los mejores ejemplos a seguir, por demostrarme siempre su cariño y apoyo incondicional. A mi hermana, por siempre estar dispuesta a escucharme, ayudarme en cualquier momento y por ayudar en mi crecimiento profesional. A mi asesor y profesor Oscar Reategui Arévalo, por siempre estar dispuesto a brindarme los conocimientos necesarios y guiarme durante todo el proyecto para poder realizar un excelente trabajo. 3 AGRADECIMIENTO Agradezco a Dios por haberme dado Vida, fortaleza y por permitirme llegar hasta este momento tan importante de mi formación profesional. Mi cordial agradecimiento a mi asesor Oscar Reategui y a la Carrera de Nutrición por confiar en mi trabajo y en mis conocimientos para ser parte del proyecto de investigación “Evaluación de la Actividad Flebotónica de especies nativas amazónicas del Perú: Sacha Culantro (Eryngium Foetidium L.) y Copaiba (Copaifera Paupera), procedentes de la Provincia de Coronel Portillo (Ucayali)”, financiada por FONDECYT (Convenio 000151-2015) y a todas las autoridades. Agradezco a mi compañero Joseph Ballarta por el apoyo mutuo brindado para realizar nuestras tesis, a los profesores Danae Liviac y Rafael Alvis que me han brindado un especial apoyo durante todo el proceso de realización del proyecto. 4 INDICE TESIS .................................................................................... ¡Error! Marcador no definido. DEDICATORIA..................................................................................................................... 3 AGRADECIMIENTO ........................................................................................................... 4 RESUMEN ............................................................................................................................ 7 1. Introducción ............................................................................................................. 8 2. Material y Métodos ...............................................................................................12 2.1 Tipo de Estudio..................................................................................................12 2.2 Población de Estudio .......................................................................................12 2.3 Área de Estudio .................................................................................................12 2.4 Diseño Estadístico ............................................................................................12 2.5 Preparación de la Muestra ..............................................................................13 2.5.1 Para el Sacha Culantro.................................................................................13 2.5.2 Para el Aceite de Copaiba ...........................................................................13 2.6 Diseño Experimental ........................................................................................13 2.6.1 Extracción de las muestras. .......................................................................13 2.6.1.1 Extracción para el Sacha Culantro. ..........................................................13 2.6.1.2 Extracción para el Aceite de Copaiba......................................................13 2.6.2 Purificación de las muestras ......................................................................14 2.6.3 Pruebas fisicoquímicas utilizadas ............................................................14 2.6.3.1 Capacidad antioxidante FRAP ...................................................................14 2.6.3.2 Flavonoides .....................................................................................................14 2.6.3.3 Polifenoles totales .........................................................................................15 2.6.3.4 DPPH .................................................................................................................15 2.6.3.5 Thiobarbutiric acid rective substances – (TBARS) ..............................15 2.6.4 Reactivos Químicos ......................................................................................16 2.6.5 Equipos ............................................................................................................16 3. Resultados ..............................................................................................................17 4. Discusión de Resultados ....................................................................................33 5. Conclusiones y Recomendaciones .................................................................40 5 6. Referencias Bibliográficas .................................................................................42 7. Anexos .....................................................................................................................47 6 RESUMEN Introducción: En las últimas décadas, muchas plantas medicinales y sus compuestos bioactivos cada vez más han estado recibiendo interés del público como medicinas complementarias y alternativas. La OMS ha sugerido la evaluación de la eficacia de estos fármacos en base a plantas medicinales, debido a la falta de información científica (Chua, 2013). En este contexto, se propone evaluar los Compuesto Bioactivos y la capacidad Antioxidante de extractos metanólicos, acetónicos y etanólicos de hoja de Sacha Culantro y acei te de copaiba con el fin de buscar contenido de Flavonoides y Polifenoles totales, tales como la Quercetina, Rutina y Kaempeferol. Objetivo. Determinar compuestos bioactivos y capacidad antioxidante de la hoja de Sacha Culantro (Eryngium foetidum L.) y del Aceite de Copaiba (Copaifera paupera) Método: Diseño de Investigación: El tipo de estudio realizado fue analítico, no experimental, transversal y prospectivo. Diseño Metodológico: Se extrajo 20Kg de hojas de Sacha Culantro de acuerdo a la técnica descrita por Reichel et al. (2011), luego se realizó la técnica de Purificación en Fase Sólida (SPE) descrita por Erakli et al. (2012), seguidamente se evaporo en presión reducida (Rotavapor) hasta obtener el extracto sólido puro, finalmente se desarrolló las pruebas físico- químicas propuestas. Del mismo modo para la extracción del Aceite de Copaiba se llevó a cabo de acuerdo a la técnica descrita por Vieira et. al. (2012) con modificaciones para su uso en la obtención de extractos Metanólicos y Etanólicos. Resultados. Para el Sacha Culantro el extracto Acetónico fue quien presentó mayor contenido de Polifenoles totales 25.6±0.2 (mg EAG/g RSP), mayor cantidad de Flavonoides 8.77±0,28 (mg Eq. Cat/100g RSP) y mayor Capacidad Antioxidante FRAP 93.86±3.37 (nmoles Fe2+ /g RSP); el Extracto Metanólico obtuvo mayor capacidad antioxidante DPPH 0.89+0.05 (µmol TEAC/g RSP- EC50) e inhibición de formación de MDA 19.60+0.56 (µg MDA/g RSP). Para el Aceite de Copaiba el extracto Metanólico fue quien presentó mayor contenido de Polifenoles totales 1.81±0.26 (mg EAG/g RP), mayor cantidad de Flavonoides 3.31±0,21 (mg Eq. Cat/100g RP) y mayor Capacidad Antioxidante FRAP 2.76±0.032 (nmoles Fe2+ /g RP) e inhibición de la formación de MDA 11.83+0.21 (µg MDA/g RP). Conclusión: Se encontró cantidades considerables en el contenido de compuestos bioactivos y capacidad antioxidante de los extractos metanólicos y acetónicas de la hoja de Sacha Culantro y Metanólicos y etanólicas del Aceite de Copaiba. Palabras Clave: Capacidad Antioxidante, Compuestos Bioactivos, Purificación (SPE), DPPH, TBARS, Residuo Sólido Purificado (RSP), Residuo Purificado (RP). 7 1. Introducción En las últimas décadas, cada vez más plantas medicinales y sus compuestos bioactivos están recibiendo mayor interés del público como medicinas complementarias y alternativas. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha sugerido la evaluación de la eficacia de estos fármacos en base a plantas medicinales debido a la falta de información científica (Chua, 2013). La Amazonía peruana cuenta con especies vegetales de reconocida actividad medicinal y otras muy poco conocidas, por lo tanto, urge que a través de técnicas científicas modernas de investigación, se evalúe los compuestos bioactivos procedentes de plantas medicinales, en especial lo relacionado al contenido de polifenoles totales y flavonoides, los que constituyen y contribuyen con la actividad antioxidante de estas plantas, cuya importancia sería vital para la prevención e interferencia de muchas enfermedades (Flores, 1997). Hoy en día, la etnomedicina, en particular en relación con los productos de la biodiversidad amazónica, se ha convertido en una herramienta importante en el desarrollo de nuevos fitofármacos. El aceite de Copaiba es un importante producto natural que se utiliza en la medicina tradicional, extraído de un árbol de 30-35 metros que pertenece a la familia Caesalpiniaceae, orden Fabales, sub-clase Rosidae y de nombre científico Copaífera paupera (Herzog)Dwyer. Los estudios farmacológicos con la oleorresina de Copaiba muestran que su uso está plenamente justificada por los indios (Garg 2012). Las pruebas in vivo y in vitro han demostrado que los aceites de varias especies de Copaifera poseen capacidad antiinflamatoria, antiséptico, cicatrización de heridas, antitumoral y antibacteriana (Lima, 2011). Con respecto al Sacha Culantro, El género Eryngium L. se distribuye en todo el mundo, principalmente en Eurasia, norte de África y sur de América (Worz, 2004). Con cerca de 250 especies, representa la más grande y taxonómicamente más complejo género de la familia Apiaceae (Calvino et al., 2007).A pesar de su uso generalizado para la gastronomía y como un agente etnomedicinal, recientemente ha habido una proliferación de investigaciones fitoquímicas en la planta. La mayor parte de estas investigaciones se concentran en los aceites esenciales volátiles 8 donde se han identificado cerca de cuarenta compuestos. Sigue existiendo una falta de información sobre los componentes más polares (flavonoides) que son propensos a ser extraído en las pruebas tradicionales usadas como medicina. Asimismo, sólo unas pocas de las supuestas propiedades farmacológicas del extracto de la planta han sido investigados y fueron realizadas in vitro como en modelos animales (Paul et al., 2011). Varios estudios han analizado las diferentes aplicaciones del Sacha Culantro, Por ejemplo, Odonne et al. (2013) indicaron que el tallo de Sacha Culantro se usa para el tratamiento de dolor de oído y malaria en la comunidad Chayahuita de la selva Peruana (Paul et al., 2011). Paul et al. (2011) sostienen que el Sacha Culantro (Eryngium foetidum) posee un amplio rango de usos etnomedicinales incluyendo el tratamiento de quemaduras, dolor de oído, fiebre, hipertensión, estreñimiento, asma, dolor de estómago, golpes, lombrices, complicaciones de infertilidad, mordedura de víboras, diarrea y malaria. La evaluación química de las hojas, indican la presencia de flavonoides, taninos, una saponina, varios triterpenoides y aceites esenciales (E-2 dodecenal). Además, Roumy et al. (2007) reportan que las hojas de Sacha Culantro en infusión se usan para el tratamiento contra la diarrea, dolor de estómago y malaria, en las zonas de Pastaza y Napo en la Selva Norte del Perú. Otra investigación afirma que el Eryngium foetidum muestra una actividad reductora sobre el Plasmodium falciparum, que es un protozoo parásito que causa la malaria (Ruiz et al. 2010). Al investigar la capacidad clastogénica y anticlastogénica de las hojas de las hojas de Eringium foetidum (EF) mediante el ensayo de micronúcleos en eritrocitos de la sangre periférica de (Promkum et al. 2012) concluyeron que EF no es clastogenico, pero posee un potencial anticlastogenicidad en ratones. Otros estudios como (García et al. 1999) determinaron que el extracto de hexano de Eryngium foetidum es rica en compuestos terpénicos y que tiene una actividad antiinflamatoria. El fraccionamiento cromatográfico de este extracto indica la presencia de alfa-colesterol, brasicasterol, campesterol, estigmasterol (como el componente principal, 95%) clerosterol, beta-sitosterol, Delta 5-avenasterol, Delta (5) 24-estigmastadienol y delta 7-avenasterol. Sáenz et al. (1997) investigaron que la decocción de las hojas de Eryngium foetidum muestran propiedades antiinflamatorias, ya que inhibe la inflamación de la oreja de ratón causada por 12- O-TPA, propiedades analgésicas y propiedades que inhiben edema inducido por carragenina en pata de rata. 9 Así mismo, Martin et. al. (2006) sostienen que las plantas pertenecientes al género Eryngium se caracterizan por su alto contenido de Saponinas, los cuales son responsables de la actividad biológica de estas especies. Las plantas también contienen flavonoides tales como Kaempeferol y Quercetina glicosiladas. El culantro espinoso es fuertemente aromático y contiene aceites esenciales formados por cerca de cuarenta compuestos de alto valor para la industria farmacéutica, de perfumería y aditivos alimentarios. El contenido relativamente alto de aceites esenciales o aromáticos en el cultivo está asociado a sus usos como condimento y planta medicinal. Generalmente se aprovechan las hojas y tallos para uso como condimento y toda la planta tiene usos medicinales. Culinariamente, el Sacha culantro es usado extensamente en la cocina del Caribe, Latinoamérica y Asia tropical, de forma similar al cilantrillo, en sofritos, salsas y pastas. Nutricionalmente, las hojas del Sacha culantro contienen un 90% de agua, pero tienen alta concentración de caroteno, calcio, hierro, vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina), vitamina C, vitamina A y proteínas. Jimenez et. al. 2016. En relación a Copaifera paupera es una especie de la Familia Fabaceae, descrita por primera vez por Theodor Carl Herzog en 1909 (Fedge 1909) y reevaluada por John Duncan Dwyer en 1951 (Missouri Botanical Garden 2016b). Esta especie presenta tres sinónimos: Copaiba paupera Herzog; Copaifera langsdorffii var. peruviana J.F. Macbr y Copaifera reticulata var. peruviana J.F. Macbr. Hay que tener mucha precaución con la identificación y diagnosis de la especie, ya que parece que se utilizan sinónimos no reconocidos taxonómicamente (por ejemplo en Taylor 2016), pudiendo llevar a confusión. Según las colectas disponibles; esta especie se encuentra en Perú (Pasco y Oxapampa), Bolivia (Santa Cruz y Cochabamba) y Brasil (Maranhão), habiéndose recolectado entre los 275 y 680 metros (Figura XXX). Brako & Zarucchi (1993) nos indican que esta especie se distribuye también en los bosques de Loreto, Madre de Dios y Ucayali, entre los 0 y 500 metros de altitud. Adzu et al. (2015) evaluaron la actividad gastroprotectora y el mecanismo de acción de estandarizado de extracto de hojas de infusión de Copaifera malmei Harms, donde se pudo impedir las ulceraciones agudas inducidas mediante la mejora de gastroprotección través de la producción gástrica de mucosa, reducción de la secreción gástrica y mejoras en el proceso de curación de las úlceras crónicas, como se mostró por la reducción/prevención del daño epitelial y vascular, además de la reducción en la infiltración de leucocitos. 10 El estudio realizado por Arroyo et al. (2011) demostró el efecto cicatrizante de copaifera officinalis (copaiba) en pacientes con úlceras peptídicas, donde demostraron que se logró el 65% y 75% de cicatrización de la úlcera peptídica con Aceite de Copaiba, sin efectos adversos significativos. Carvalho et al. (2005) describe que la oleo-resina de varias especies de Copaifera son usadas ampliamente en la región amazónica principalmente como tópico antiinflamatorio y un agente de curación y evidenciaron que la oleo-resinda de Copaifera Duckei contiene tópica antiinflamatoria y actividades analgésicas. Tincusi et al. (2002) aislaron compuestos a partir de la oleo-resina de la planta medicinal peruana Copaifera Paupera, con el fin de evaluarlo como leishmanicida, antimicrobiano, citotóxico y actividad inhibitorias de la aldosa reductasa. Según sus resultados ciertos compuestos mostraron una actividad antimicrobiana significativa (MIC <10 µg/mL) contra las bacterias Gram-positivas. Así mismo un compuesto exhibió actividad citotóxica moderada contra cuatro líneas celulares del cáncer. Además, Cascon et al. (2000) al analizar la caracterización de la oleo- resina de la Copaifera guianensis Desf., Copaifera duckei Dwyer and Copaifera multijuga Hayne, donde encontraron actividades como antihelminítico, analgésico, gastro-protector, anti-tumoral y tripanocida por parte de la oleo-resina. Rohloff et al. (2013) reportó que la oleorresina de Copaifera paupera, con mayor constituyente es el β-bisaboleno, contiene un efecto anti Leishmaniasis. Do Nascimento et al. (2012) al estudiar los compuestos volátiles dentro de la hoja, ramas, semillas y pericarpio, de 5 especímenes de Copaifera langsdorffii, indicaron la presencia de b-cariofileno, germacreno D, espatulenol, óxido de cariofileno e iso-espatulenol. En este contexto, se evaluó los compuestos bioactivos y la capacidad antioxidante de los extractos metanólicas, acetónicas de la hoja de Sacha Culantro y metanólicos y etanólicas del Aceite de Copaiba. Este estudio formó parte del proyecto “Evaluación de la Actividad Flebotónica de especies nativas amazónicas del Perú: Sacha Culantro (Eryngium Foetidium L.) y Copaiba (Copaifera Paupera), procedentes de la Provincia de Coronel Portillo (Ucayali)”, financiada por FONDECYT (Convenio 000151-2015). 11 2. Material y Métodos 2.1 Tipo de Estudio El tipo de estudio realizado fue observacional de tipo no experimental, analítico y transversal. 2.2 Población de Estudio Las muestras de sacha culantro (Eryngium foetidum L.) y la oleorresina de copaiba (Copaifera paupera), se recolectaron en la estación experimental agroforestal “A. von Humboldt “de INIA-Pucallpa, Provincia de Coronel Portillo-Ucayali, Perú, las que fueron recolectadas e identificadas por el Dr. Eloy Cuellar, Sub-Director del INIA-Pucallpa. Se trabajó con 20 kg de hojas de Sacha Culantro fresco y con 5 kg de la Oleoresina Copaiba. 2.3 Área de Estudio Programa de Valorización de la Biodiversidad (FONDECYT-151-2015). 2.4 Diseño Estadístico Los resultados de todas las pruebas se presentaron como la media de 3 determinaciones ± desviación estándar (SD). Las diferencias entre las medias se determinaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis, la cual analiza muestras independientes. La correlación de variables se hizo mediante la prueba de Pearson. El análisis estadístico se corrió por el paquete estadístico SPSS 21. 12 2.5 Preparación de la Muestra 2.5.1 Para el Sacha Culantro De la planta fresca se separaron las raíces y se lavaron las hojas. Después del oreado, se seleccionaron y se clasificaron las hojas, de acuerdo al tamaño, color, daño o magulladuras. En seguida se sometió a secado en estufa de aire forzado (40°C durante 72h), luego la muestra fue molida y almacenada en frascos de vidrio ámbar en refrigeración hasta su extracción. 2.5.2 Para el Aceite de Copaiba La muestra fue recolectada en frasco de vidrio ámbar y almacenada en refrigeración hasta el día de realización de la extracción. 2.6 Diseño Experimental 2.6.1 Extracción de las muestras. 2.6.1.1 Extracción para el Sacha Culantro. Se llevó a cabo de acuerdo a la técnica descrita por Reichel et al. (2011), adaptada para el Sacha Culantro, el cual se describe en el Anexo 1. 2.6.1.2 Extracción para el Aceite de Copaiba. Se llevó a cabo de acuerdo a la técnica descrita por Vieira et al. (2012) con modificaciones para su uso en la obtención de los extractos metanólicos y etanólicos, para el Aceite de Copaiba, el cual se describe en el Anexo 2. 13 2.6.2 Purificación de las muestras Los extractos metanólicos y acetónicos de Sacha Culantro, fueron sometidos al método de Purificación por SPE (Solid Phase Extraction), de acuerdo a la técnica descrita por Irakli et al. (2012), tal como se observa en el Anexo 3. 2.6.3 Pruebas fisicoquímicas utilizadas 2.6.3.1 Capacidad antioxidante FRAP Técnica propuesta por Benzie y Strain (1996), descrita por Szollosi y Varga (2002). El procedimiento se llevó a cabo utilizando 1.0 mL de agua destilada y 1.0 mL del reactivo FRAP, los cuales se añadieron a la muestra de Sacha Culantro y de Aceite Copaiba (20 µL). Luego se llevaron a baño María a 37 °C durante 15 minutos y se procedió a leer en el espectrofotómetro (593 nm). Con el propósito de calcular la capacidad antioxidante de las muestras, se preparó una curva estándar utilizando diversas concentraciones Fe²⁺. 2.6.3.2 Flavonoides Técnica descrita por Wolfe et al. (2003) para la determinación de Flavonoides, el medio de reacción estuvo constituido por 250 µL de muestra, 125 µL de agua y 75 µL de nitrito de sodio al 5%. Se dejó reposar por 5 minutos y luego se adicionó 150 µL de tricloruro de aluminio (solución al 10%). Se dejó reposar nuevamente por 6 minutos y por último se agregó 0.5 mL de hidróxido de sodio 2M y 275 µL de agua. Se procedió a leer en el espectrofotómetro a 510 nm. 14 2.6.3.3 Polifenoles totales Técnica propuesta por Singleton y Rossi (1965), descrita por Naczk y Shahidi (2006). Para la determinación de polifenoles se utilizó 1.0 mL de Folin – Ciocalteu (solución al 10%), 0.1 mL de la muestra y se dejó en reposo durante cinco minutos, a cuyo término se adicionó 1.0 mL de carbonato de sodio (solución al 7.5%). Luego, se llevaron a baño María por 15 minutos a 45 °C y se procedió a darles lectura en el espectrofotómetro a 725nm. 2.6.3.4 DPPH Técnica propuesta por Brand-Williams et al. (1995), descrita por Szydlwska – Czerniak et al. (2011). Esta determinación se realizó utilizando distintas concentraciones de muestra las que fueron colocadas en tubos conteniendo 1 mL de tampón acetato pH 6.0 (0.1 M), 0.5mL metanol y 0.5 mL de DPPH (0.1 mM), se procedió a agitar fuertemente, se llevaron a baño maría a 37 °C durante 30 minutos a cuyo término se leyeron en el espectrofotómetro a 517 nm. Paralelamente se preparó un blanco que no contenía muestra ni el reactivo DPPH y para realizar los cálculos se utilizaron tubos de control que no contenían muestra. 2.6.3.5 Thiobarbutiric acid rective substances – (TBARS) Técnica descrita por Draper y Hadley (1990) que evalúa el grado de lipoperoxidación midiendo la formación de malondialdehido (MDA) utilizando el reactivo ácido Tiobarbitúrico en presencia de ácido tricloroacético, el producto formado se midió en el espectofotómetro a 532 nm. 15 2.6.4 Reactivos Químicos El TPTZ (2, 4,6- Tris 2-Piridil- s- Triazina), se adquirieron de de la Sigma Chemical Co. El reactivo de Folin Ciocalteau, carbonato de sodio, cloruro férrico, Monofosfato, Difosfato, Ascorbato, Desoxiribosa, Cobre 2, Ácido Tiobarbitúrico, ácido acético, ácido ascórbico, ácido gálico, catequina, metanol, etanol, acetona, nitrito de sodio, cloruro de aluminio y ácido tricloroacético se adquirieron de la casa comercial Merck-Darmstadt y el sulfato ferroso de Scharlau. Todos los reactivos fueron de grado p.a. 2.6.5 Equipos - Espectofotómetro Spectroquant. Modelo Pharo 300. - Balanza analítica digital Sartorius Extend, modelo ED224S. - Balanza de precisión digital Sartorius Element, modlo ELT6000. - Centrifuga Hettich Zentrifugen, Modelo Mikro 22R. - Equipo baño maría Memmert de 14 L. - Estufa MM GROUP, Modelo Venticell 55. - Unidad Succionadora para preparación de muestras (SPE). Marca Lichrolut. - Rotavapor, Marca Selecta, modelo RS 3000V. 16 3. Resultados Los resultados de los compuetos bioactivos y capacidad antioxidante (FRAP, DPPH y TBARS) de extractos metanólico y acetónico de Sacha Culantro se muestran en la Tabla 1, los que se expresaron en base al residuo sólido purificado (RSP). Los extractos metanólicos y mcetónicos mostraron diferencias significativas según la pruebla de Kruskal-Wallis (p˂0.05) El contenido de Polifenoles totales del extracto metanólico y acetónico fueron de 16.09±0.52 y 25.6±0.25 mg EAG/g RSP, respectivamente. El contenido de flavonoides del extracto metanólico y acetónico fueron de 3.58±0.121 y 8.77±0,28 mg Eq. Cat/g RSP, respectivamente. Con respecto a la capacidad antioxidante, la prueba FRAP de los extractos metanólico y acetónico fueron de 44.63±0.65 y 93.86±3.37 µmoles Fe ²⁺/g RSP, respectivamente. La pueba DPPH, expresada como EC50, de los Extractos metanólico y acetónico fueron de 0.8924+0.0503 y 0.8723+0.0030 µmol TEAC/g RSP, respectivamente. La prueba de TBARS de los extractos metanólico y acetónico fueron de 19,60±0,56 y 23,48±1,41 mg MDA/g de RSP, respectivamente. Los resultados de los compuetos bioactivos y capacidad antioxidante (FRAP y TBARS) de extractos metanólico y etanólico del aceite de Copaiba se muestran en la Tabla 2, los que se expresaron en base al residuo purificado (RP). Los extractos metanólicos y etanólicos muestran diferencias significativas según la pruebla de Kruskal-Wallis (p˂0.05) El contenido de Polifenoles totales del extracto metanólico y etanólico fueron de 1.81±0.26 y 0.49±0.00 mg EAG/g RP, respectivamente. El contenido de Flavonoides del extracto metanólico y etanólico fueron de 3.31±0.21 y 0.65±0,014 mg Eq. Cat/g RP, respectivamente. Con respecto a la capacidad Antioxidante, la prueba FRAP de los extractos metanólico y etanólico fueron de 2.76±0.032 y 2.428±0.084 µmoles Fe ²⁺/g RP, respectivamente. La prueba de TBARS de los extractos metanólico y etanólico fueron de 11,83±0,21 y 14,17±0,37 mg MDA/g de RP, respectivamente. 17 Tabla 1: Compuetos Bioactivos y Capacidad Antioxidante de Extractos Acetónico y Metanólico de Sacha Culantro. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE Polifenoles Flavonoides Totales DPPH (mg Eq. Cat/g FRAP (mg EAG/g (µmol TEAC/g TBARS (µg RSP) (µmoles Fe ²⁺/g RSP) RSP) MDA/g de RSP) RSP) EC50 Extracto 16.09±0.52a 3.58±0.121a 44.63±0.65a 0.8924+0.0503a 19,60±0,56a Metanólico Extracto 25.6±0.2b 8.77±0,28b 93.86±3.37b 0.8723+0.0030b 23,48±1,41b Acetónico a,b Letras diferentes dentro de la misma columna, significa que hay diferencias significativas (p>0.05). Los valores se expresan como la media + desviación estándar. 18 Tabla 2: Compuetos Bioactivos y Capacidad Antioxidante de Extractos Acetónico y Etanólico de Aceite de Copaiba. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE Polifenoles Flavonoides Totales (mg Eq. Cat/g FRAP DPPH (mg EAG/g TBARS (µg RP) (µmoles Fe ²⁺/g (µmol TEAC/g RP) RP) MDA/g de RP) RP) EC50 Extracto 1.81±0.26a 3.31±0.21a 2.76±0.032a ND 11,83±0,21a Metanolico Extracto 0.49±0.00b 0.65±0,014b 2.428±0.084b ND 14,17±0,37b Etanólico a,b Letras diferentes dentro de la misma columna, significa que hay diferencias significativas (p>0.05). Los valores se expresan como la media + desviación estándar. 19 En la relación FRAP/Polifenoles (Figura 1) el hallazgo más resaltante fue del extracto acetónico de la muestra seca purificada de la hoja de Sacha Culantro en la que se halló que por 25.6 mg EAG/g RSP se elevaban los valores FRAP en 93.86 µmoles Fe ²⁺/g RSP. Con relación al extracto metanólico del RSP de la hoja de Sacha Culantro se halló que por 16.09 mg EAG/g RSP se elevaban los valores FRAP en 44.63 µmoles Fe ²⁺/g RSP. La correlación FRAP/Polifenoles presenta una alta significancia, demostrándose de esta manera que a mayor concentración de polifenoles totales los valores FRAP van en aumento, existiendo una relación directa (r2=0.991). En la relación FRAP/Flavonoides (Figura 2) el hallazgo más resaltante fue del extracto acetónico del RSP de la hoja de Sacha Culantro en la que se halló que por 8.77 mg Eq. Cat/g RSP se elevaban los valores FRAP en 93.86 µmoles Fe ²⁺/g RSP. Con relación al extracto metanólico del RSP de la hoja de Sacha Culantro se halló que por 3.58 mg Eq. Cat/g se elevaban los valores FRAP en 44.63 µmoles Fe ²⁺/g RSP. La correlación FRAP/Flavonoides totales presenta una alta significancia demostrándose de esta manera que a mayor concentración de Flavonoides los valores FRAP van en aumento, existiendo una relación directa (r2=0.999). En la relación DPPH/Polifenoles (Figura 3) se encontró que el extracto acetónico del RSP de la hoja de Sacha Culantro, cada 25.6 mg EAG/g RSP contribuyeron con los valores DPPH en 0.8723 µmol TEAC/g RSP. Con relación al extracto metanólico del RSP de la hoja de Sacha Culantro se halló que por 16.09 mg EAG/g RSP se elevaban los valores DPPH en 0.8924 µmol TEAC/g RSP. La relación DPPH/Polifenoles totales presenta una baja significancia no existiendo así una relación directa (r2=0.313). En la relación DPPH/Flavonoides (Figura 4) se encontró que el extracto acetónico del RSP de la hoja de Sacha Culantro, cada 8.77 mg Eq. Cat/g muestra seca contribuyeron con los valores FRAP en 0.8723 µmol TEAC/g RSP. Con relación al extracto metanólico de la RSP purificada de la hoja de Sacha Culantro se halló que por 3.58 mg Eq. Cat/g se elevaban los valores DPPH en 0.8924 µmol TEAC/g RSP. En la relación DPPH totales presenta una baja significancia no existiendo así una relación directa (r2=0.385). En la relación TBARS/Polifenoles (Figura 5) el hallazgo más resaltante fue del extracto acetónico del RSP de la Hoja de Sacha Culantro en la que se halló que por 25.6 mg EAG/g RSP se elevaban los valores TBARS en 23,48 µg MDA/g de RSP. Con relación al extracto metanólico de la RSP de la hoja de Sacha 20 Culantro se halló que por 16.09 mg EAG/g RSP se elevaban los valores TBARS en 19,60 µg MDA/g de RSP. La relación TBARS/Polifenoles totales presenta una alta significancia demostrándose de esta manera que a mayor concentración de polifenoles totales, los valores TBARS van en aumento, existiendo una relación directa (r2=0.922). Con respecto a la relación TBARS/Flavonoides (Figura 6) el hallazgo más resaltante fue del extracto acetónico del RSP de la hoja de Sacha Culantro en la que se halló que por 8.77 mg Eq. Cat/g RSP se elevaban los valores TBARS en 23,48 µg MDA/g de RSP. Con relación al extracto metanólico del RSP de la hoja de Sacha Culantro se halló que por 3.58 mg Eq. Cat/g se elevaban los valores TBARS en 19,60 µg MDA/g de RSP. La relación TBARS/Flavonoides totales presenta una alta significancia demostrándose de esta manera que a mayor concentración de flavonoides, los valores TBARS van en aumento, existiendo una relación directa (r2=0.906). 21 100 90 80 70 60 50 Metanolico 40 Acetonico 30 20 10 0 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 POLIFENOLES (mg EAG/g muestra seca) Figura 1.- Capacidad Antioxidante utilizando la técnica FRAP. Relación FRAP/Polifenoles totales de los Extractos Metanólicos y Acetónicos de la muestra seca purificada de la Hoja de Sacha Culantro. (r2 =0.991). La correlación es significativa al nivel 0.01. 22 FRAP (µmoles Fe ²⁺/g RSP) 100 90 80 70 60 50 Metanolico 40 Acetonico 30 20 10 0 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 FLAVONOIDES (mg Eq. Cat/g muestra seca) Figura 2.- Capacidad Antioxidante utilizando la técnica FRAP. Relación FRAP/Flavonoides de los Extractos Metanólicos y Acetónicos de la muestra seca purificada de la Hoja de Sacha Culantro. (r2 =0.999). La correlación es significativa al nivel 0.01. 23 FRAP (µmoles Fe ²⁺/g RSP 0.895 0.89 0.885 Metanolico 0.88 Acetonico 0.875 0.87 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 POLIFENOLES (mg EAG/g muestra seca) Figura 3.- Capacidad Antioxidante utilizando la técnica DPPH. Relación DPPH/Polifenoles totales de los Extractos Metanólicos y Acetónicos de la muestra seca purificada de la Hoja de Sacha Culantro. (r2=0.313). La correlación es significativa al nivel 0.01. 24 DPPH (µmol TEAC/g RSP) EC50 0.895 0.89 0.885 Metanolico 0.88 Acetonico 0.875 0.87 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 FLAVONOIDES (mg Eq. Cat/g muestra seca) Figura 4.- Capacidad Antioxidante utilizando la técnica DPPH. Relación DPPH/Flavonoides de los Extractos Metanólicos y Acetónicos de la muestra seca purificada de la Hoja de Sacha Culantro. (r2=0.385). La correlación es significativa al nivel 0.01. 25 DPPH (µmol TEAC/g RSP) EC50 24 23.5 23 22.5 22 21.5 Metanolico 21 Acetonico 20.5 20 19.5 19 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 POLIFENOLES (mg EAG/g muestra seca Figura 5.- Capacidad Antioxidante utilizando la técnica TBARS. Relación TBARS/Polifenoles totales de los Extractos Metanólicos y Acetónicos de la muestra seca purificada de la Hoja de Sacha Culantro. (r2 =0.922). La correlación es significativa al nivel 0.01. 26 TBARS (µg MDA/g de RSP) 24 23.5 23 22.5 22 21.5 Metanolico 21 Acetonico 20.5 20 19.5 19 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 FLAVONOIDES (mg Eq. Cat/g muestra seca) Figura 6.- Capacidad Antioxidante utilizando la técnica TBARS. Relación TBARS/flavonoides de los Extractos Metanólicos y Acetónicos de la muestra seca purificada de la Hoja de Sacha Culantro. (r2 =0.906). La correlación es significativa al nivel 0.01. 27 TBARS (µg MDA/g de RSP) En la relación FRAP/Polifenoles (Figura 7) el hallazgo más resaltante fue del extracto metanólico del Aceite de Copaiba se halló que por 1.81 mg EAG/g de RP se elevaban los valores FRAP en 2.76 µmoles Fe ²⁺/g RP. Con relación al extracto etanólico del Aceite de Copaiba se halló que por 0.49 mg EAG/g de RP se elevaban los valores FRAP en 2.428 µmoles Fe ²⁺/g RP. La relación FRAP/Polifenoles totales presenta una alta significancia demostrándose de esta manera que a mayor concentración de polifenoles totales, los valores FRAP van en aumento, existiendo una relación directa (r2=0.941). En la relación FRAP/Flavonoides (Figura 8) el hallazgo más resaltante fue del extracto metanólico del Aceite de Copaiba se halló que por 3.31 mg Eq. Cat/g de RP se elevaban los valores FRAP en 2.76 µmoles Fe ²⁺/g RP. Con relación al extracto etanólico del Aceite de Copaiba se halló que por 0.65 mg Eq. Cat/g de RP se elevaban los valores FRAP en 2.428 µmoles Fe ²⁺/g RP. La relación FRAP/Flavonoides totales presenta una alta significancia demostrándose de esta manera que, a mayor concentración de flavonoides, los valores FRAP van en aumento, existiendo una relación directa (r2=0.940). En la relación TBARS/Polifenoles (Figura 9), el hallazgo más resaltante fue del extracto etanólico del Aceite de Copaiba se halló que por 0.49 mg EAG/g de RP se elevaban los valores TBARS en 14,17 µg MDA/g de RP. Con relación al extracto metanólico de la muestra del Aceite de Copaiba se halló que por 1.81 mg EAG/g RP se elevaban los valores TBARS en 11,83 µg MDA/g RP. La relación TBARS/Polifenoles totales presenta alta significancia (r2=0.962). En la relación TBARS/Flavonoides (Figura 10) el hallazgo más resaltante fue del extracto etanólico del Aceite de Copaiba se halló que por 0.65 mg Eq. Cat/g RP se elevaban los valores TBARS en 14,17 µg MDA/g de muestra. Con relación al extracto metanólico del Aceite de Copaiba se halló que por 3.31 mg Eq. Cat/g RP se elevaban los valores TBARS en 11,83 µg MDA/g RP. La relación TBARS/Flavonoides presenta alta significancia (r2=0.980). 28 3 2.5 2 1.5 Metanolico Etanólico 1 0.5 0 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 POLIFENOLES (mg EAG/g muestra seca) Figura 7.- Capacidad Antioxidante utilizando la técnica FRAP. Relación FRAP/Polifenoles totales de los Extractos Metanólicos y Etanólicos de la muestra seca purificada del Aceite de Copaiba. (r2 =0.941). La correlación es significativa al nivel 0.01. 29 FRAP (µmoles Fe ²⁺/g RP) 3 2.5 2 1.5 Metanolico Etanólico 1 0.5 0 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 FLAVONOIDES (mg Eq. Cat/g muestra seca) Figura 8.- Capacidad Antioxidante utilizando la técnica FRAP. Relación FRAP/Flavonoides de los Extractos Metanólicos y Etanólicos de la muestra seca purificada del Aceite de Copaiba. (r2 =0.940). La correlación es significativa al nivel 0.01. 30 FRAP (µmoles Fe ²⁺/g RP) 14.5 14 13.5 13 Metanolico Etanólico 12.5 12 11.5 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 POLIFENOLES (mg EAG/g muestra seca) Figura 9.- Capacidad Antioxidante utilizando la técnica TBARS. Relación TBARS/Polifenoles totales de los Extractos Metanólicos y Etanólicos de la muestra seca purificada del Aceite de Copaiba. (r2 = 0.962). La correlación es significativa al nivel 0.01. 31 TBARS (µg MDA/g de RP) 14.5 14 13.5 13 Metanolico Etanólico 12.5 12 11.5 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 FLAVONOIDES (mg Eq. Cat/g muestra seca) Figura 10.- Capacidad Antioxidante utilizando la técnica TBARS. Relación TBARS/flavonoides de los Extractos Metanólicos y Etanólicos de la muestra seca purificada del Aceite de Copaiba. (r2 = 0.980). La correlación es significativa al nivel 0.01. 32 TBARS (µg MDA/g de RP) 4. Discusión de Resultados Sacha Culantro (Eryngium Foetidum L.) El presente trabajo determinó el contenido de los compuestos bioactivos y de la capacidad antioxidante de la hoja de Sacha Culantro (Eryngium foetidium L.). Con tal propósito se han utilizado tres técnicas destinadas a cuantificar la actividad antioxidante: DPPH, FRAP y TBARS; así mismo, se han determinado los contenidos de Flavonoides y Polifenoles, metabolitos que en gran parte son los responsables de las propiedades antioxidantes de muchos alimentos. Raunelli et al (2019), usando los resultados reportados en el presente estudio, concluyó que los extractos de la hoja de Sacha Culantro (Eryngium foetidium L.) no produce mortalidad o respuesta de comportamiento anormal en su población de estudio, con una dosis letal 50 (LD-50) >5000mg/kg. Además, al estudiar la genotoxicidad inducida, se demostró que la hoja de Sacha Culantro (Eryngium foetidium L.) puede mitigar la citotoxicidad del NaF reduciendo el daño que produce en el ADN celular. Polifenoles Totales El contenido de Polifenoles totales varió entre los diferentes tipos de extracción de la hoja de Sacha Culantro. El contenido de Polifenoles totales se determinó por la técnica de Folin-Ciocalteau, el cuál varió entre 16.09 y 25.6 mg EAG/g RSP para los extractos metanólico y acetónico respectivamente. Singh et al (2013) reportaron contenidos de Polifenoles totales de hojas de Sacha Culantro, valores de 2.237 y 2.332 mg EAG/g RSP de extracto metanólico y acetónico respectivamente, siendo menores a los resultados obtenidos en la presente investigación, toda vez que se trataron de extractos sin haber sido sometidos a purificación por SPE. Así mismo se puede observar un orden descendiente de eficacia de los solventes usados para la extracción de polifenoles, es decir, el extracto acetónico prevalece sobre el extracto metanólico, tanto en el trabajo de Singh et al; así como en el presente estudio ejecutado. Garg et al (2012) reportaron el contenido de Polifenoles totales de las hojas de la especie Corandium sativam (familia apiaceae), valores de 1.67 mg EAG/g de extracto metanólico, siendo menores a los resultados obtenidos en el proyecto ejecutado. Sin embargo, Vukic et al (2018), reportaron valores de 311.11 mg EAG/g de extracto metanólico para la especie Eryngium serbicum L., planta oriunda de Serbia, distribuida principalmente en Eurasia; siendo mayores a los resultados 33 obtenidos en la presente investigación. Harsha y Anilakumar (2012), obtuvieron valores de polifenoles totales en hoja de culantro (Coriandrum sativum), especie recolectada en Mysore, India, de 133.74 mg EAG/g, siendo mayores a los resultados obtenidos durante la presente investigación, quienes secaron las hojas a la sombra durante 3 días, hasta un contenido de humedad de 7%, donde la muestra fue remojada durante toda la noche en etanol al 70% para su extracción. Por otro lado, Singh et al (2013) sostuvieron que los extractos acuosos de las hojas de sacha culantro muestran alta extracción de compuestos polifenólicos, lo que determina su potencial como alimento funcional, por lo que es consumido predominantemente como ensaladas y encurtidos. En la selva peruana, las hojas de Sacha Culantro, se usan predominantemente para la preparación de sudado de pescado y diferentes tipos de sopas. Flavonoides El contenido de flavonoides varió entre los diferentes tipos de extracción de la hoja de Sacha Culantro. El contenido de flavonoides se determinó por la técnica descrita por Wolfe et al. (2003), el cuál varió entre 3.58 y 8.77 mg Eq. Cat/g RSP para los extractos matanólico y acetónico respectivamente. Garg et al (2012) reportaron el contenido de flavonoides de las hojas de la especie Corandium sativam (familia apiaceae), valores de de 1 mg Eq. Cat/g, estos valores tienen similitud con el estudio obtenido por Yanza (2014), donde los valores de flavonoides en culantro (Corandium sativum) fueron de 805 µg Eq. Cat/g. El menor rendimiento de sus extractos, pudo ser debido a que los extractos fueron preparados usando el aparato Soxhlet a diferencia que en este estudio usamos el SPE. Singh et al (2013) reportaron contenidos de flavonoides de hojas de Sacha Culantro, valores de 1.746 y 1.803 mg Eq. Rut/g. de extracto metanólico y acetónico respectivamente, siendo menores a los resultados obtenidos en la presente investigación, toda vez que se trataron de extractos sin haber sido sometidos a purificación por SPE y su equivalente son expresado en mg de eq. Rutina/g y los resultados del presente estudio son expresados en mg de eq. Catequina/g. Así mismo se puede observar un orden descendiente de eficacia de los solventes usados para la extracción de flavonoides, es decir, el extracto acetónico prevalece sobre el extracto metanólico, tanto en el trabajo de Singh et al (2013); así como en el presente estudio ejecutado. 34 Sin embargo, Vukic et al (2018), reportaron valores de 154.98 mg Eq. Cat/g de extracto metanólico para la especie Eryngium serbicum L., planta oriunda de Serbia, distribuida principalmente en Eurasia; siendo mayores a los resultados obtenidos en la presente investigación. FRAP La Capacidad Antoxidante FRAP varió entre los diferentes tipos de extracción de la hoja de Sacha Culantro, siendo más elevada en la extracción acetónica que en la metanólica con un contenido de 93.86+3.37 y 44.63+0.65 µmoles Fe ²⁺/g RSP, respectivamente. Este método se basa en la capacidad de la muestra para reducir los iones Fe+3 a Fe+2 en presencia del reactivo TPTZ. No existen estudios que muestren la determinación de la actividad FRAP en la hoja de Sacha Culantro (Eryngium foetidum L.) ni plantas similares; sin embargo, Sreeramulu et al (2010) muestran que la relación FRAP/Polifenoles Totales muestran una significativa correlación lineal en diversos vegetales (r2=0.87), similares resultados obtenidos en nuestro estudio en la relación FRAP/Polifenoles Totales que mostramos en la Figura 1 y la relación FRAP/Flavonoides que mostramos en la figura 2 de la hoja de Sacha Culantro con (r2=0.991) y (r2=0.999) respectivamente, fundamentalmente reportando mayor reducción de iones Fe+3 en los extractos acetónicos tanto como para polifenoles como para flavonoides. DPPH Para la evaluación de la inhibición del radical DPPH de los diferentes tipos de extracción de la hoja de Sacha Culantro, se obtuvo como referencia la concentración efectiva al 50% (EC50), cuyos resultados son 0.8924+0.0503 y 0.8723+0.0030 µmol TEAC/g RSP para la extracción metanólica y acetónica, respectivamente. Ceballos y Giraldo (2015), determinaron la actividad antioxidante por la técnica del catión ABTS+, y reportaron que en el extracto de las hojas es mayor que en el extracto de tallos de cilantro (Coriaundum sativum L.), cuyas concentraciones son de 0.6345±0.0511 y 0.2155±0.0280 µmol TEAC/g respectivamente, obteniendo así resultados notoriamente menores a los nuestros. Sin embargo, Jaramillo et al. (2011), determinaron la actividad antioxidante en el aceite esencial de las hojas de E. foetidum, expresada como porcentaje de 35 inhibición del radical DPPH en 89,39%. Así mismo, Rodriguez (2014), evaluó la actividad antioxidante del aceite esencial de Eryngium foetidum L. “siuca culantro”, obteniendo una inhibición del radical DPPH expresado en porcentaje de captación de 70% equivalente a 150mg de TEAC/mL de muestra. Toda vez que fue expresado en porcentaje de inhibición según concentración del extracto; en el presente estudio se obtuvo como referencia la concentración efectiva al 50% (EC50). No se reportaron estudios que relacionen el contenido de Polifenoles totales ni flavonoides con el porcentaje inhibitorio del radical DPPH, sin embargo, en los trabajos de Rodriguez (2014) y Jaramillo et. al. (2011), reportaron que hubo una reducción significativa en el radical DPPH al igual que en nuestro estudio, los que se muestran en la figura 3 y 4, que a mayor cantidad de Polifenoles totales y Flavonoides la inhibición del radical DPPH es mayor, fundamentalmente en el extracto acetónico. TBARS Para la determinación de TBARS se midió la inhibición del MDA formado en el control, por medio del cual los extractos metanólico y etanólico inhibieron la formación de la lipoperoxidación, haciendo efectivo los resultaos que se expresaron como mg MDA/ g de muestra seca purificada. La Capacidad Antoxidante TBARS varió entre los diferentes tipos de extracción de la hoja de Sacha Culantro, siendo más elevada en la extracción acetónica que en la metanólica con un contenido de 23.48+1.41 y 19.60+0.56 µg MDA/g RSP, respectivamente. No existen estudios que muestren la Capacidad antioxidante TBARS en la hoja de Sacha Culantro (Eryngium foetidum L.); sin embargo, Sreelata et. al. (2009) evaluaron la capacidad antioxidante TBARS en hígado de rata inducidas con extractos de hoja de Coriandrum sativum, obteniendo resultados de 1,46 y 1,29 nmol MDA/ mg de proteína a dosis de 100 y 200mg/kg, respectivamente, y con extractos del tallo de Coriandrum sativum, obteniendo resultados de 1,52 y 1,43 nmol MDA/ mg de proteína a dosis de 100 y 200mg/kg, respectivamente. Estos resultados indicaron que los radicales libres, de ser liberado en el hígado, fueron neutralizados con eficacia cuando se tratan con la hoja y tallo extractos de C. sativum. Así mismo, Moudache et. al. (2016) determinaron la capacidad antioxidante TBARS en carne fresca de cerdo que fue protegida con diferentes extractos de hoja de olivo, obteniendo valores finales de 0.19 μg de MDA Kg-1, los cuales indicaban una notoria disminución en la lipoperoxidación de la carne. 36 No se reportaron estudios que relacionen el contenido de Polifenoles Totales ni flavonoides con la capacidad antioxidante TBARS, sin embargo, en el presente estudio se pudo determinar que mientras mayor es el contenido de Polifenoles y Flavonoides en la hoja de en la hoja de Sacha Culantro (Eryngium foetidum L) mayor es la formación de MDA, indicando que los extractos de sacha culantro no son los adecuados para evitar la lipoperoxidaciòn. Aceite de Copaiba (Copaifera paupera) El presente trabajo determinó el contenido de los compuestos bioactivos y de la capacidad antioxidante del Aceite de Copaiba (Copaifera paupera). Con tal propósito se han utilizado tres técnicas destinadas a cuantificar la actividad antioxidante: DPPH, FRAP y TBARS; así mismo, se han determinado los contenidos de Flavonoides y Polifenoles, metabolitos que en gran parte son los responsables de las propiedades antioxidantes de muchos alimentos. Liviac et al (2019), usando los resultados reportados en el presente estudio, concluyeron que la oleorresina del Aceite de Copaiba (Copaifera paupera) pudo mitigar la citotoxicidad de la Cyclophosphamide que produce daño en el DNA. Siendo así el primer reporte publicado de la antigenotoxicidad de la Copaiba (Copaifera paupera). Polifenoles Totales El contenido de Polifenoles totales varió entre los diferentes tipos de extracción del Aceite de Copaiba. El contenido de Polifenoles totales se determinó por la técnica de Folin-Ciocalteau, el cuál varió entre 1.81+0.26 y 0.49+0.00 mg EAG/g de RP para los extractos metanólico y etanólico, respectivamente. No existen estudios que muestren el contenido de Polifenoles totales del ceite de Copaiba, sin embargo, Batista et. al. (2016), cuantificaron el contenido de Polifenoles totales de la pulpa de Copaiba (Copaifera langsdorffii fruit) en 0.03 y 0.125 mg EAG/g de muestra seca para los extractos metanólicos y etanólicos respectivamente, siendo menores que nuestros resultados, toda vez que evaluó la pulpa del fruto de copaiba. Muñoz Sisniegas (2005) determinó el contenido de Polifenoles totales de hojas y cortezas de Copaifera Paupera, encontrando así 0.1455+0.002 mg EAG/g de muestra seca para los extractos metanólico de las Hojas y 0.046+0.004 mg EAG/g de muestra seca para los extractos metanólico de la corteza de la Copaifera 37 Paupera; siendo menores a los resultados obtenidos en nuestra investigación en hojas de Aceite de Copaiba (Copaifera Paupera). Flavonoides El contenido de Flavonoides varió entre los diferentes tipos de extracción del Aceite de Copaiba (Copaifera Paupera). El contenido de flavonoides se determinó por la técnica descrita por Wolfe et al. (2003), el cuál varió entre 3.31+0.21 y 0.65+0.14 mg Eq. Cat/g RP para los extractos metanólico y etanólico respectivamente. No existen estudios que muestren el contenido de flavonoides del Aceite de Copaiba, sin embargo, Batista et. al. (2016) estudió el contenido de Flavonoides de la pulpa de Copaiba (Copaifera langsdorffii fruit) encontrando así 0.01 y 0.5 mg mg Eq. Cat/g de muestra seca para los extractos metanólicos y etanólicos respectivamente, siendo menores que nuestros resultados, toda vez que evaluó la pulpa del fruto de copaiba. FRAP La capacidad antoxidante FRAP varió entre los diferentes tipos de extracción del Aceite de Copaiba (Copaifera Paupera), siendo más elevada en la extracción Metanólina que en la Etanólica con un contenido de 2.76+0.032 y 2.428+0.084 µmoles Fe ²⁺/g RP, respectivamente. No existen estudios que muestren la determinación de la actividad FRAP en el Aceite de Copaiba; sin embargo, Batista et. al. (2016) estudiaron la capacidad antioxidante FRAP de la pulpa de Copaiba (Copaifera langsdorffii fruit) encontrando así 0.8 y 0.6 µmoles Fe ²⁺/g de muestra seca para los extractos metanólicos y etanólicos respectivamente, siendo menores que nuestros resultados, toda vez que evaluó la pulpa del fruto de copaiba. Asi mismo, en las figuras 7 y 8 se pueden observar claramente la correlación positiva entre el contenido de Polifenoles totales y Flavonoides frente a la capacidad antioxidante FRAP, indicando que ambas contribuyen con su poder reductor frente al Fe+3. DPPH Para la evaluación de la inhibición del radical DPPH de los diferentes tipos de extracción del Aceite de Copaiba (Copaifera Paupera), se obtuvo como referencia la concentración efectiva al 50% (EC50), sin embargo, no se detectó inhibición del radical en ninguno de los extractos evaluados. 38 TBARS La lipoperoxidación es un mecanismo general por medio del cual los radicales libres pueden inducir el daño al tejido y han sido implicados en muchas condiciones patológicas, el cual se midió por los niveles de TBARS. Para la determinación de TBARS se midió la inhibición del MDA formado en el control, por medio del cual los extractos metanólico y etanólico inhibieron la formación de la lipoperoxidación, haciendo efectivo los resultados que se expresaron como mg MDA/ g de muestra seca purificada. La capacidad antioxidante TBARS varió entre los diferentes tipos de extracción del Aceite de Copaiba (Copaifera Paupera), siendo más elevada en la extracción etanólina que en la metanólica con un contenido de 14.17+11.83 y 11.83+0.21 µg MDA/g RP, respectivamente. Baldissera et. al. (2014) aplicaron diferentes dosis de aceite de tres variedades de Copaiba, entre ellas Copaifera Paupera a ratones de experimentación, los que fueron analizados en 3 tratamientos, para evaluar el efecto protector contra la lipoperoxidación. Los resultados indicaron que no existen diferencias significativas entre el grupo control y los grupos sometidos a dosis de los tres tipos de copaiba. Más aún, encontraron daño hepatotóxico y nefrotóxico en todos los tratamientos. Por otro lado, no se reportaron estudios que relacionen el contenido de Polifenoles totales ni Flavonoides con la capacidad antioxidante TBARS, sin embargo, se puede observar en las Figuras 9 y 10, tanto para el extracto etanólico como para el metanólico, el efecto citoprotector aumenta con el contenido de Polifenoles totales y Flavonoides, ya que hay menor formación de MDA. 39 5. Conclusiones y Recomendaciones 5.1 Se encontró cantidades significativas en el contenido de compuestos bioactivos y capacidad antioxidante de los extractos metanólicos, acetónicas de la hoja de Sacha Culantro y metanólicos y etanólicas del Aceite de Copaiba. 5.2 Existen diferencias significativas entre el contenido de Polifenoles, Flavonoides, FRAP, DPPH y TBARS de los extractos metanólico y acetónico de la hoja de Sacha Culantro. 5.3 Existen diferencias significativas entre el contenido de Polifenoles, Flavonoides, FRAP y TBARS de los extractos metaólico y etanólico del Aceite de Copaiba. 5.4 El extracto acetónico de la hoja de Sacha Culantro presentó el mayor contenido de compuestos bioactivos como los Polifenoles totales y Flavonoides. 5.5 El extracto metanólico del aceíte de Copaiba presentó el mayor contenido de compuestos bioactivos como los Polifenoles totales y Flavonoides. 5.6 El sacha culantro mostró una buena actividad antioxidante FRAP y DPPH pero pobre acción en la reducción de MDA. 5.7 El aceite de copaiba mostró una buena actividad antioxidante FRAP y buena reducción de MDA, pero no se detectó su capacidad inhibidora del radical DPPH. 5.8 Se recomienda evaluar el uso de Sacha culantro como suplemento nutricional, teniendo en cuenta las técnicas de cocción y las preparaciones a elaborar, por su alto contenido de Polifenoles, Flavonoides y capacidad antioxidante FRAP y DPPH demostrada. 5.9 Se recomienda evaluar la acción del extracto de hojas de Sacha Culantro como inhibidor de la lipoperoxidación en comidas con altos contenidos de grasa debido a su poca acción frente a la formación de MDA. 40 5.10 Se recomienda el uso de Sacha Culantro como alimento de uso Nutrigenómico por su gran protección al daño inducido al ADN celular. 5.11 Se recomienda el uso del Aceite de copaiba como alimento de uso Nutrigenómico por su gran protección al daño inducido al ADN celular. 41 6. Referencias Bibliográficas 1) Adzu, B.; Balogun, S.O.; Pavan, E.; Ascêncio, S.D.; MendesSoares, I.; Souza Aguiar, R.; Ribeiro, R.V.; Silva Beserra, A.; Oliveira, R.; Silva, L.; Damazo, A.; Oliveira Martins, D. 2015. Evaluation of the safety, gastroprotective activity and mechanism of action of standardized leaves infusion extract of Copaifera malmei Harms. Journal of Ethnopharmacology. Vol 175: 378-389 pp. 2) Aleksandra Szydłowska-Czerniak; Iwona Bartkowiak-Broda; Igor Karlovic; Gyorgy Karlovits; Edward Szłyk. 2011. Antioxidant capacity, total phenolics, glucosinolates and colour parameters of rapeseed cultivars. Food Chemistry 127: 556-563pp. 3) Arroyo, J.; Quino, M.; Martínez, J.; Almora, Y.; Alba, A.; Condorhuamán, M. 2011. 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Aceite de Copaiba (4 g) 80 mL de Metanol (80%) Baño María (37°C x 3 h) con agitación Centrifugado (2000g x 10 min) Sobrenadante Rotavapor (evaporación al vacío a 38°C) Estufa 0.1 mg del residuo sólido en 3mL (2mL H2O USP + 1mL DMSO) 50 Anexo 3: Flujograma de la Purificación SPE. (Irakli et al. 2012). Extracción MetOH: 2.5 g materia prima + 40 mL MetOH acidificado con TCA 0.1% Homogenización x 30ˈ / Filtrado por gravedad papel Whatman N°1 Purificación SPE Evaporación en el Rotavapor Resuspensión del extracto: 0.5 -1 mL DMSO 100% Identificación de compuestos bioactivos: HPLC-DAD-MS RP18 columna Acondicionar la columna con 3 mL de MetOH pa Equilibrar con 3 mL agua ultrapura acidificada con HCL (pH 2) Agregar 3 mL de muestra acidificada con HCl 0.1M (pH 2)/ Ajustar la bomba a 80 gotas/min Elución con 2 mL MetOH en agua ultrapura (70:30) acidificada con ácido acético 1% 51 Anexo 4: Imagen 1: Selección, clasificación y Secado. Imagen 2: Extracto de Hoja de Sacha Culantro 52 Imagen 3: Pruebas de determinación de Capacidad Antioxidante de los distintos extractos Imagen 4: Prueba de DPPH 53 Anexo 5: Artículos Científicos publicados. 54 55