FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y BIOLÓGICAS CARRERA PROFESIONAL DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA “CÉLULAS MADRE ADIPOSAS DE PERROS CON ENFERMEDAD CLÍNICA DE DISTEMPER ESTÁN INFECTADAS POR EL MORBILLIVIRUS CANINO” Tesis para optar el título profesional de: MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA Presentado por: Mabel Fabiola Altamirano Samaniego (0000-0002-0934-6601) Asesor: Javier Alejandro Enciso Gutiérrez (0000-0002-9167-7329) Lima – Perú 2022 DEDICATORIA A mi esposo, mis hijos y mis tíos César y Mili, por su apoyo constante. AGRADECIMIENTO A mi asesor, por sus grandes enseñanzas y cualidades como profesional y persona. Células madre adiposas de perros con enfermedad clínica de distemper están infectadas por el Morbillivirus canino. Fabiola Altamirano-Samaniego1, Javier Enciso-Benavides3, Nancy Rojas4, Juan Manuel Iglesias-Pedraz2, Nathaly Enciso1, Matia Fossatti2, Javier Enciso1,5 1 Grupo de Medicina Regenerativa. Universidad Científica del Sur. Lima. Perú 2 Laboratorio de Bioquímica y Genética Molecular. Universidad Científica del Sur. Lima. Perú. 3 Laboratorio de Células Madre. Clínica Veterinaria Enciso. Lima. Perú. 4 Laboratorio de Microscopía Electrónica. Facultad de Medicina. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima. Perú 5 Autor principal: jenciso@cientifica.edu.pe RESUMEN La medicina regenerativa en caninos empleando células madre alogénicas exige que dichas células estén libres de agentes infectocontagiosos, siendo el Morbillivirus canino (MC) responsable del distemper canino, uno de los más importantes. Además, la persistencia y latencia viral de este virus son eventos en que aún no se precisan las células de larga vida donde se hospedan estos virus. El objetivo de este trabajo fue determinar si las células madre adiposas (CMA) de caninos con la enfermedad clínica, están infectadas por el Morbillivirus canino. Con este fin se identificaron 12 perros con diagnóstico clínico de la enfermedad del distemper canino en fase nerviosa, luego, mediante RT-PCR se detectó el MC en orina y/o líquido cefalorraquídeo. Posteriormente, a partir de muestras de tejido adiposo del omento menor, en un laboratorio de células madre se aislaron y caracterizaron CMA de los perros infectados. Mediante fluorescencia directa de los cultivos se detectó presencia de antígeno viral, y por citometría de flujo y RT-PCR en 2 cultivos se identificaron cultivos con poblaciones detectables del MC. Por microscopía electrónica de transmisión se confirmó la presencia de partículas del MC dentro de CMA. Los resultados demuestran por primera vez, según nuestro conocimiento, que las CMA de omento de perros con enfermedad de distemper pueden estar infectadas por el MC, postulando su posible participación en la latencia y/o persistencia de este virus, sugiriendo que debe considerarse su detección en el control de calidad de células madre a ser usadas en medicina regenerativa. Palabras clave: enfermedad de distemper canino, células madre adiposas, morbillivirus canino, latencia viral, terapia celular ABSTRACT This study aimed to determine whether adipose stem cells (ASCs) from dogs with distemper disease are infected with Canine Morbillivirus (CM). Twelve dogs with the neurological phase of the disease and positive for CM by RT-PCR were studied. ASCs from adipose tissue of the lesser omentum of these infected dogs were isolated and characterized. The virus antigen was detected in cell cultures using direct fluorescence, and detectable amounts of the virus were identified in 2 cultures using flow cytometry and RT-PCR. The CM particles within ASCs was confirmed using electron microscopy. Results show that the ASCs of the omentum of dogs with distemper disease can be infected with CM, posing their possible involvement in this virus’s latency and persistence, which suggests that its detection should be considered within the quality control process of stem cells intended fo r regenerative medicine. To our knowledge, this is the first study to demonstrate that omentum ASCs from dogs with distemper disease can be infected with CM and may be involved in viral latency or persistence. These results suggest that the detection of CM should be considered within the quality control process of stem cells intended for regenerative medicine. Keywords: canine distemper disease, adipose stem cells, canine morbillivurs, viral latency, cell therapy. INTRODUCCIÓN La latencia viral es considerada un estado de infección metaestable y no productivo que puede reactivarse posteriormente para repetir el ciclo de infección. Existen numerosas patologías asociadas con las infecciones virales latentes, tales como defectos congénitos, neuropatía, inflamación crónica, disfunciones inmunológicas, enfermedad cardiovascular y cáncer. Existe también una gran complejidad en los mecanismos que controlan el establecimiento, mantenimiento y reactivación de la latencia. Asimismo, estos mecanismos están diversificados entre familias de virus, especies y cepas. La erradicación del virus latente es lo que hoy se ha convertido en un reto importante, aunque esquivo. Requerirá una clara y completa comprensión de los mecanismos que controlan estos procesos [1]. Algunos virus ARN pueden establecer infección persistente dentro del hospedero, lo cual ocasionalmente lleva a una enfermedad reactivada o crónica. Se trata de una estrategia que algunos virus han desarrollado mediante mecanismos específicos que conducen al establecimiento de este tipo de infección en al menos algunos individuos de una población, los que pueden actuar como reservorios del virus [2]. La latencia típicamente ocurre en células que no son permisivas para la expresión genética del ciclo lítico [3], la expresión génica de los genes de latencia requiere microambientes celulares y tisulares que sean excepcionalmente permisivos [4]. La carencia de expresión de antígenos de parte de células infectadas con partículas virales que han entrado en estado de latencia hace que la detección por el sistema inmune sea nula [5]. En muchos casos como el citomegalovirus este estado de latencia hace difícil identificar el tipo de célula huésped [6], ocurriendo lo mismo con otros tipos de virus. Los modelos de cultivo celular que recapitulan la infección latente proporcionan información valiosa sobre los procesos del huésped que regulan el establecimiento del virus y el mantenimiento de la latencia, como por ejemplo en los herpes virus (HSV1). Usando estos modelos se puede estudiar la latencia en células neuronales primarias de rata tratadas con factor de crecimiento neural (NGF) [7, 8, 9]. Por otro lado, las células madre (CM) son multipotentes y muchas persisten a lo largo de la vida en numerosos tejidos de mamíferos, reemplazando a las células perdidas por renovación homeostática, lesión y enfermedad. Sin embargo, la función de las células madre disminuye con la edad en varios tejidos, incluido el prosencéfalo [10, 11, 12]. En los tejidos de los mamíferos, la mayoría de estas células se mantienen en un estado de quiescencia, dividiéndose intermitentemente para mantener la homeostasis del tejido [13], lo que en algunos casos podría facilitar la latencia o persistencia viral. Esta cualidad de quiescencia de las células madre, las hace candidatas para ser blanco de agentes infecciosos que hacen latencia y/o persistencia, como los virus. La disminución en la función de las células madre contribuye con la degeneración, la disfunción y envejecimiento de los tejidos regenerativos [14]. En este contexto, podríamos predecir que, si estas células son infectadas por un virus que luego entra en latencia, éste puede acelerar el envejecimiento celular por disfunción celular y dar origen a enfermedades neurodegenerativas. La medicina veterinaria, en la actualidad, emplea las células madre para tratar diferentes patologías. Es por ello que su rol como células blanco para la determinación de la presencia de virus latente es clave para evitar la transmisión viral. El Morbillivirus canino (MC) es considerado uno de los agentes infecciosos más letales de los carnívoros [15] y causa la enfermedad del distemper en perros, la cual es una de las más importantes a nivel mundial en esta especie por ser letal y altamente contagiosa [16, 17], además, es un virus que puede causar enfermedad neurológica asociada a latencia y persistencia viral [18, 19], por lo que debemos identificar las células donde persisten posteriormente a la infección. Sobre el MC se plantea desde hace muchos años que tiene un mecanismo de persistencia viral aún no explicado molecularmente, el cual le permite invadir el sistema nervioso central sin necesidad de liberar grandes cantidades de partículas virales [20]. Asimismo, se ha descrito infección persistente con eliminación de partículas virales hasta 17 meses pos-infección primaria [21]. Por otro lado, se ha descrito que el virus Zika reduce el crecimiento de organoides a partir de células madre embrionarias produciendo apoptosis de estas células [22]. También se ha demostrado que hay comunicación cruzada entre virus y células madre, mediante los microARNs [23], lo cual puede ser útil para explorar estrategias terapéuticas que lleven al control de infecciones virales, así como para conocer los mecanismos de latencia y reactivación empleando células madre [24]. Tomando como base todo lo que se conoce hasta este momento sobre latencia viral y la biología de las células madre multipotentes, postulamos que estas células podrían ser candidatas como hospederas del MC y el primer paso clave es demostrar que el MC infecta dichas células. En ese sentido, el objetivo de este estudio fue determinar si las células madre adiposas (CMA) del omento menor de perros con enfermedad clínica de distemper pueden estar infectadas por el MC. MATERIALES Y MÉTODOS Este trabajo se realizó en los Laboratorios de Cultivo Celular e Inmunología y en el Laboratorio de Biología y Genética Molecular de la Universidad Científica del Sur y en el Laboratorio de Células Madre de la Clínica Veterinaria Enciso, Santiago de Surco, Lima. Para la ejecución de este trabajo se obtuvo la aprobación del protocolo de investigación por parte de la Comisión de Ética de la Universidad Científica del Sur de Lima, Perú, mediante resolución No. 68-CIEI- AB-CIENTIFICA-2019 (código de registro 048-2018-PRE16). Muestras de estudio El estudio se realizó con diferentes muestras tales como líquido cefalorraquídeo, orina, sangre, omento menor de 12 perros sin tomar en consideración raza, sexo ni edad; priorizando la casuística requerida para el estudio: diagnóstico clínico de distemper canino (DC) en fase nerviosa y con diagnóstico positivo a antígenos del MC mediante pruebas cromatográficas rápidas realizadas en diferentes clínicas veterinarias. Se excluyeron los perros que recibieron vacuna previamente. Previamente a la obtención de las diferentes muestras se obtuvo el consentimiento informado de los propietarios de los animales. El estudio fue abordado como un estudio descriptivo, transversal, no probabilístico por conveniencia. Determinación de infección con Morbillivirus canino Perros con distemper canino Una vez seleccionados los perros, en el Laboratorio de la Clínica Veterinaria se corroboró en muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR), orina o sangre, mediante inmunofluorescencia empleando el anticuerpo policlonal contra el virus distemper canino (VMRD Inc, USA), y mediante RT-PCR empleando como sondas P1: 5’- ACA GGA TTG TTG CTG AGG ACC TAT - 3’ y P2: 5´- CAA GAT AAC CAT GTA CGG TGC - 3’ que permiten amplificar un fragmento de ADN de alrededor de 290 pares de bases (pb) del gen de la nucleoproteína del virus distemper canino. Células madre adiposas infectadas con Morbillivirus canino Aislamiento de células madre adiposas Una vez que los especímenes fueron incorporados a este estudio se tomaron muestras de tejido adiposo de omento menor, previa anestesia con xylacina y ketamina (Agrovet Market Perú) en dosis de 0.2 mg/kg vía IM y Tramadol 2 mg/kg por vía IM [25]. Las muestras de tejido adiposo se depositaron de inmediato en medio de cultivo de células DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (Gibco) + 1% de penicilina / estreptomicina / anfotericina 1% (Gibco) y se enviaron al laboratorio para aislamiento de CMA; mientras que en crioviales se tomaron muestras de líquido cefalorraquídeo (1 mL), orina (3 mL) o sangre (3 mL) que se remitieron de inmediato al Laboratorio para la detección del MC. Previamente, el propietario había dado su consentimiento informado. Para el aislamiento de las células mesenquimales se siguió el protocolo descrito por Enciso et al. (2019) [26]. En resumen, la muestra se sometió a disgregación mecánica y enzimática, luego se centrifugó y se eliminó el sobrenadante. La fracción de células madre mesenquimales obtenidas se cultivaron en frascos con medio de cultivo y en condiciones de cultivo celular. Cuando el cultivo alcanzó una confluencia de 70%, se realizó un pasaje para lo cual las células se desprendieron y se subcultivaron en otro frasco. Cuando se obtuvo el segundo pasaje las células se criopreservaron a -80°C hasta ser utilizadas. Además, para confirmar que eran células mesenquimales se realizó la diferenciación en tejido adipogénico, condrogénico y osteogénico según protocolo establecido por Enciso et al. (2020) [27]. Como células de control negativo se emplearon CMA caninas libres del MC que se mantuvieron criocongeladas en el banco de células madre del mismo laboratorio de la Clínica Veterinaria. Como células de control positivo se utilizaron células madre adiposas libres de MC infectadas con la cepa viral atenuada Onderstepoort contenida en una vacuna comercial (“Nobivac® Puppy DP” Pfizer). Detección del virus Inmunofluorescencia Mediante esta técnica se determinó la presencia del virus a nivel celular siguiendo el protocolo de Agallou et al. (2014) [28], cultivando las células de primer pasaje en laminillas cubreobjetos estériles. Luego, las células madre adiposas fueron cosechadas y fijadas en acetona durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de una incubación con 1:1000 del anticuerpo policlonal contra el MC conjugado con isotiocianato de fluoresceína (CJ-F-CDV- 10M. VMRD, Inc. Pullman, WA 99163, USA), a 37°C durante 1 hora, ubicándolas en una cámara húmeda. Se aplicó buffer pH 7,0, dejando en incubación por 10 minutos con DAPI a concentración 1 en 20,000 a temperatura ambiente. Luego, las muestras fueron lavadas con buffer fosfato salino (PBS) varias veces, seguidamente se añadió la solución de montaje para ser leídas en un microscopio de fluorescencia (Nikon) [28, 29]. Citometría de Flujo Para corroborar presencia y población de células madre adiposas infectadas con el MC, células del pasaje 2 fueron descongeladas y pasaron por una tinción intracelular siguiendo el protocolo modificado de tinción intracelular de Foster et al. (2007) [30] y Amidzadeh et al. (2014) [31]. En resumen, se lavaron las células con PBS por tres veces centrifugando a 500 g durante 10 minutos cada vez, luego se fijaron las células durante 15 minutos con PBS/PFA 2% a temperatura ambiente. Posteriormente fueron centrifugadas a 500 g por un lapso de 10 minutos y se lavaron con PBS tres veces más. Seguidamente se permeabilizaron las células añadiendo 200 µL de PBS/Tween 20 al 0.2% durante 30 minutos y se centrifugaron a 500 g durante 10 minutos y se lavaron 3 veces más con PBS, para finalmente incubar las células con anticuerpos contra virus distemper canino (Canine Distemper Virus (CDV) FITC Conjugate. VMRD, Inc. Pullman, WA 99163, USA) durante 30 minutos a 4°C, luego, se lavaron y se realizó la citometría de flujo usando Guava Easy-Cyte™ (Merck/Millipore), los resultados fueron analizados usando FlowJo V10. RT-PCR Se determinó la presencia de ARN viral dentro de las células madre aisladas mediante RT-PCR. Para la detección de ARN viral de MC, se aisló ARN utilizando innuPREP Virus DNA/RNA Kit® (Jena, Alemania) luego se siguió el protocolo propuesto por el fabricante. La cuantificación del ARN se realizó mediante el Fluorómetro Qubit (Invitrogen™, USA) siguiendo el protocolo propuesto por el fabricante del producto. El diagnóstico molecular RT-PCR se realizó mediante el mismo protocolo y sondas propuestas por Frizk et al. 1999 [32]. Para la síntesis de ADNc se utilizó el ARN obtenido y se realizó según los componentes y concentraciones detalladas a continuación (ARN, 1 ng – 2 µg./rxn; Random primers, 0.5 µM; dNTP; 500 µM; H2O), los cuales fueron llevados al termociclador 65°C por 5 minutos y 4°C durante 1 minuto. Luego se adicionaron los siguientes componentes en las concentraciones correspondientes (Buffer, 1X; Ribosome inhibitor, 20 U/rxn; OneScript, 200 U/rxn), para ser llevados al termociclador a 94°C por 60 segundos para la desnaturalización inicial, 40 ciclos para las etapas de desnaturalización (94°C, 60 seg), alineación (60°C, 120 seg) y elongación (72°C, 120 seg), y por último, 72°C por 10 minutos para la etapa de extensión final. En la reacción RT-PCR se utilizaron sondas para amplificar el gen de la nucleoproteína (NP) del virus de distemper canino y corresponden a P1: 5’ – ACA GGA TTG CTG AGG ACC TAT - 3’ y a P2: 5’ – CAA GAT AAC CAT GTA CGG TGC - 3’ (producto de 290 pb). Estas sondas permiten amplificar un fragmento de ADN de alrededor de 290 pb del gen de nucleoproteína del virus. El protocolo de PCR consiste en un periodo de desnaturalización de 94°C por 3 minutos, luego sigue un periodo de 35 ciclos, los cuales comprenden un periodo de desnaturalización de 94°C durante 30 segundos, alineación de 59.5°C por 30 segundos y elongación de 72°C durante 30 segundos. Como última etapa, un ciclo final de extensión de 72°C durante 5 minutos. La electroforesis se efectuó en gel de agarosa al 2%, a 110 de voltaje y se usó el marcador 100bp Plus Opti-DNA Marker®. Luego de la electroforesis, se incubó el gel con bromuro de etidio (0,5 μg/mL) durante 30 minutos. A continuación, se observó en un transiluminador de luz ultravioleta. Finalmente fue fotografiado, como se aprecia en la Figura 6. Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) El inicio del procedimiento para el análisis por MET consistió en cultivar aquellas células con fenotipo de CMA para MET en medio de cultivo DMEM (Sigma), para luego suplementar con suero fetal bovino 10% y penicilina / estreptomicina 1%. Para este procedimiento los cultivos fueron suspendidos nuevamente y a continuación, mediante centrifugación, concentrados en tubos de microcentrífuga. En estos, se fijaron, se lavaron y luego post fijados utilizando una solución con el siguiente contenido: glutaraldehído al 2,5% en buffer fosfato 0,1 M, pH 7,2, por un lapso de 30 minutos. Posteriormente, con el propósito de retirar el excedente de fijador, se lavaron con buffer fosfato para, a continuación, post fijarlos en una campana extractora, utilizando OsO4 al 1% en agua bidestilada durante un periodo de 60 minutos. A continuación, se procedió con la deshidratación. Esto se realizó en una batería de alcohol etílico de grado ascendente, partiendo de 30% y llegando hasta etanol absoluto. La parte final concluyó con dos pasos de acetona. Seguidamente se procedió con la infiltración con la resina epoxi. Los pasos fueron los indicados a continuación: mezcla de acetona y resina Epón – Araldita (1:1), durante una noche completa; Acetona - resina (1:2), durante 2 horas; resina pura, dos cambios durante 2 horas. Los cambios fueron realizados considerando, en todos los casos, la centrifugación de los tubos con tres minutos de anticipación al cumplimiento de los tiempos recomendados para cada uno de los pasos indicados. Asimismo, utilizando una estufa eléctrica a 60°C, se polimerizaron las muestras ya infiltradas. Como paso siguiente, se tallaron y cortaron los tacos obtenidos, en un ultramicrótomo. empleando cuchillas de vidrio. Posteriormente se hicieron los cortes ultrafinos. Estos se recogieron en rejillas de cobre de 300 mesh, se impregnaron los cortes con acetato de uranilo y citrato de plomo, de acuerdo con las especificaciones de Reynolds (1963) [33]. Los cortes se analizaron y fotografiaron en un microscopio electrónico de transmisión Modelo Tecnai, marca FEI del Laboratorio de Microscopía Electrónica de Transmisión, Servicio de Anatomía Patológica, Instituto Nacional de Salud del Niño, San Borja, Lima. RESULTADOS Determinación de infección por Morbillivirus canino Perros con distemper canino Mediante RT-PCR e inmunofluorescencia empleando anticuerpo anti CDV (VMRD, USA) se detectó el virus en las muestras de orina y líquido cefalorraquídeo (LCR) de los 12 perros en estudio. Células madre adiposas infectadas con Morbillivirus canino Según el protocolo establecido, se obtuvieron 12 aislados de CMA. Estos se mantuvieron en medio de cultivo DMEM – Gibco 31600-026 1L + 1% de penicilina / estreptomicina / anfotericina 1% (Gibco 15240062). Al microscopio invertido, las células madre de los cultivos fueron adherentes al plástico. Presentaron morfología alargada, comparable con la de fibroblastos, lo cual, fue ratificado por MET (Figura 1). En este trabajo no se observó en cultivos celulares el efecto citopático que ha sido descrito para este virus. Al diferenciar en los tres linajes de consenso (adipogénico, condrogénico y osteogénico) se demuestra la multipotencialidad de estos aislados. En estos linajes se identifican los tipos celulares según las tinciones correspondientes: adipocitos, tinción Oil Red O; osteoblastos, Alcian Blue; osteócitos, Alizarin red S. De esta manera, se evidencia material mineralizado, siendo estas cualidades establecidas como inherentes a células madre adultas [34]. Luego del análisis de estos aislados de células madre adiposas se confirmó en dos de ellos la presencia del Morbillivirus canino (MC). Figura 1. Células madre infectadas con virus de Distemper canino. N: núcleo. C: matriz citoplasmática; NC: nucleocápsides virales intracitoplasmáticas. MET. Detección del virus Inmunofluorescencia Mediante inmunofluorescencia empleando anticuerpo específico para CDV y luego de cultivar por 72 horas las células madre adiposas de pasaje 1 de perros con la enfermedad clínica de distemper, se pudo constatar presencia del CDV en dichas células, (Figura 2.B y Figura 3 A y B), similarmente las células control con CDV vacunal también evidenciaron presencia viral (Figura 2.A). En cambio, las células madre adiposas no infectadas que fueron control negativo no evidenciaron reacción fluorescente. Figura 2. A) Células madre adiposas infectadas con CDV vacunal. 40X. B) Células madre adiposas de perros con infección natural por el CDV. 100X. Figura 3. Células madre adiposas. Células de perros con infección natural por Morbillivirus canino. Tinción DAPI (A) e IFD con anticuerpo anti CDV. 40X. Citometría de Flujo Se evaluaron 12 aislados del pasaje 2 de células madre adiposas de perros con la enfermedad distemper canino, empleando anticuerpos anti CDV-FITC, y como control negativo se usaron células madre adiposas caninas obtenidas de un perro libre de MC. De los 12 aislados que presentaron diferentes poblaciones de células que van de >2 -8%, las muestras 3 (perra mestiza de aproximadamente 4 meses) y 12 (perra mestiza, cruce con Boxer, de aproximadamente 6 meses) tuvieron mayor porcentaje de células positivas a CDV, mientras que el control negativo correspondiente a un perro sano evidencia <1% (Figura 4 y 5). Figura 4. Porcentaje de células madre adiposas positivas al CDV en los aislados de los perros en estudio. Figura 5. Citometría de flujo. Protocolo de selección, usando un blanco de células madre de individuo sanos (curva azul) frente a células madre de individuos enfermos (curva roja). RT-PCR Mediante RT-PCR se buscó el MC siguiendo el protocolo descrito en materiales y métodos de este trabajo, demostrando presencia del virus en 2 muestras (muestras 3 y 12) de células madre adiposas aisladas a partir de perros con la enfermedad de distemper (Figura 6). Figura 6. Electroforesis del RT-PCR de células madre adiposas de perros con distemper. P3 y P12 son muestras positivas, tienen bandas similares a C+ que es el control positivo. C- es el control negativo. Microscopía Electrónica de Transmisión Mediante MET se constató presencia de viriones en la periferia del citoplasma de células madre adiposas, así como acúmulos de nucleocápsides virales (Figura 7) que fueron obtenidas a partir del omento menor de perros que clínicamente mostraban enfermedad de distemper. Las células infectadas con varias partículas virales en el citoplasma tenían grandes grupos de cuerpos lamelares e inclusiones citoplásmicas con nucleocápsides virales y vacuolización (Figura 8), mientras que a nivel nuclear se observaron núcleos con lisis de matriz nuclear y cromatina marginal (Figura 9). Figura 7. Células madre infectadas con el virus distemper canino (CDV). Nucleocápside intracitoplasmática (flecha). CDV: Virión en la periferia celular. MET. Figura 8. Morbillivirus canino (CDV). Inclusión citoplasmática con nucleocápsides virales (NC). MET. Figura 9. Célula madre infectada con CDV. Núcleo con lisis de matriz nuclear y cromatina marginal. Acúmulos de vesículas de doble membrana en el citoplasma (VES). MET. DISCUSIÓN En este trabajo se demuestra por primera vez que el MC, que causa una infección sistémica afectando una amplia gama de órganos y tejidos, infecta también células madre adiposas de perros con enfermedad de distemper con signología nerviosa. Esto se corrobora al evidenciar mediante citometría, partículas virales; por RT-PCR, genes virales; y por MET, partículas virales maduras, en aislados de dichas células. Este hecho demuestra que las células madre adiposas son susceptibles de infectarse por el MC, pero se observa que las células infectadas con el MC no evidenciaron el efecto citopático que se ha descrito en otros trabajos [35], es decir, aquellos cambios que ocurren a nivel celular, inducidos por el virus. A la MET sí se observaron cambios como presencia de viriones en la periferia del citoplasma, acúmulos de nucleocápsides virales, presencia de cuerpos lamelares e inclusiones citoplasmáticas con nucleocápsides virales y vacuolización. El MC es un virus ARN monocatenario de sentido negativo [36] que infecta múltiples células del perro con predilección por células circulantes, células epiteliales y células nerviosas [37], mientras que las células madre adiposas son inmaduras y no se ha demostrado susceptibilidad a este virus. En ese sentido, los resultados mostrados en este trabajo difieren de lo que propone EZ Poirier y colaboradores recientemente, quienes demuestran que las células madre se protegen de un virus ARN expresando una isoforma de la enzima Dicer denominada aviD, la cual potencia la interferencia antiviral del ARN limitando la infección por virus ARN de las células madre de mamíferos [38]. Por otro lado, en este estudio, mediante citometría de flujo encontramos que de los 12 aislados de CMA en el segundo pasaje, obtenidos a partir del omento menor de perros con la enfermedad de distemper en fase nerviosa, dos aislados tenían partículas virales en alto porcentaje de sus poblaciones, lo cual fue ratificado mediante RT-PCR. Los demás aislados fueron negativos para MC mediante esta técnica, a pesar de que todos los animales de donde procedían las muestras fueron positivos al CDV mediante prueba rápida. Esto se explicaría porque posiblemente la etapa de desarrollo de la enfermedad en los animales de los cuales procedían las muestras negativas aún no involucraba el tejido adiposo. Estos resultados permiten proponer que los MC dentro de las células madre adiposas podrían encontrarse en una fase de latencia, lo que explicaría la ausencia de efecto citopático debido al silenciamiento de los genes relacionados con la lisis [39]. Esta hipótesis se sustenta en lo descrito para el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) que sostiene que el entorno de bajo oxígeno del ganglio linfático puede suprimir la replicación del VIH y promover latencia [40]. Precisamente, se ha demostrado en ratones que las concentraciones de oxígeno en el tejido adiposo se encuentran en aproximadamente un 3% [41]. También es importante considerar que otro estudio demuestra la participación de las células madre mesenquimales en la reactivación de la latencia del VIH [42]. En conclusión, los resultados de este trabajo demuestran que las células madre adiposas de perros con la enfermedad clínica del distemper canino en fase nerviosa están infectadas por el Morbillivirus canino sin causar efecto citopático evidente en cultivo celular. Esto postularía su participación en la latencia de este virus. En ese sentido, es importante sugerir que las células madre adiposas usadas para terapia regenerativa deben pasar un tamizaje de este virus como parte del control de calidad. AGRADECIMIENTO Este trabajo fue financiado parcialmente por la Universidad Científica del Sur mediante el contrato No.048-2018-PRE16. Agradecemos al centro de diagnóstico por imágenes y laboratorio veterinario, ZooDx, por su valioso aporte para la realización de este proyecto. Asimismo, agradecemos a la Veterinaria Aristocat por facilitar casos de distemper, cuyos propietarios accedieron ceder para fines de investigación. Se agradece a Luis Alfaro Quillas y Wilfredo Pérez Solorzabal por su apoyo en la recolección de muestras y espécimenes animales. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Lieberman, P.M. Epigenetics and Genetics of Viral Latency. Cell Host Microbe. 2016, 19, 5, 619-628. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27173930 2. Randall, R.E.; Griffin, D.E. 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