FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y BIOLÓGICAS CARRERA PROFESIONAL DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA “EVALUACIÓN DE LA SALUD INTESTINAL EN GALLINAS DEKALB BROWN DE 18 A 29 SEMANAS DE EDAD SUPLEMENTADAS CON ÁCIDOS ORGÁNICOS, FITOGÉNICOS Y BACTERICIDA QUÍMICO” Tesis para optar el título profesional de: MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA Presentado por: Sara Isabel Lujan Trigozo (0000-0002-7936-2180) Asesora: Connie Gallardo Vela (0000-0002-8070-8767) Lima – Perú 2021 ESTE TRABAJO FUE FINANCIADO POR EL APORTE DEL LABORATORIO BIOVET S.A (ESPAÑA). A LA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA POR BRINDAR LAS INSTALACIONES PARA EL PRESENTE ESTUDIO. A LA DOCTORA CONNIE GALLARDO POR TODO EL APOYO Y LA PACIENCIA INFINITA. A MI FAMILIA Y A MI ENAMORADO POR SIEMPRE MOTIVARME A SER MEJOR. “EVALUACIÓN DE LA SALUD INTESTINAL EN GALLINAS DEKALB BROWN DE 18 A 29 SEMANAS DE EDAD SUPLEMENTADAS CON ÁCIDOS ORGÁNICOS, FITOGÉNICOS Y BACTERICIDA QUÍMICO” "INTESTINAL HEALTH ASSESSMENT IN DEKALB BROWN LAYING HENS FROM 18 TO 29 WEEKS OF AGE SUPPLEMENTED WITH ORGANIC ACIDS, PHYTOGENICS AND CHEMICAL BACTERICIDE” Sara Isabel Luján-Trigozo1; Connie Gallardo-Vela1 1Carrera de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Científica del Sur, Km. 19 Panamericana Sur, Lima 12. 2 Email: cgallardov@cientifica.edu.pe RESUMEN La calidad de los huevos de gallinas ponedoras producidos en las granjas está directamente vinculada a una serie de cuidados en el manejo, sanidad y alimento de las aves. Para que los resultados cumplan con las expectativas del productor, es importante tener en cuenta los factores que impactan directamente en la rentabilidad de la actividad. El objetivo de esta investigación fue determinar el efecto de un bactericida fitogénico, ácidos orgánicos y químico sobre la salud intestinal en las gallinas de postura de 18 a 29 semanas de edad. En total 144 gallinas Dekalb Brown se utilizaron considerando 4 tratamientos (T1-dieta control (DC) sin aditivos, T2- DC más ácidos orgánicos; T3- DC más fitogénico y T4-DC más bactericida químico), divididas en 6 repeticiones con 6 gallinas por jaula. A las 18 y 29 semanas de edad se extrajo el intestino de 2 gallinas por cada repetición para evaluar las características macroscópicas, relación vellosidades intestinales/criptas de lieberkühn y la concentración de bacterias presentes en el intestino. Microscópicamente, el intestino delgado fue evaluado de acuerdo al grado de lesión presentada. No hubo diferencias estadísticas (p > 0.05) entre los tratamientos experimentales en la longitud de las vellosidades y profundidad de criptas a las 18 semanas de edad, a las 29 semanas se encontró diferencias estadísticas (p < 0.05) con el fitogénico en la relación entre vellosidades intestinales/criptas de Lieberkühn. La inclusión del fitogénico y ácidos orgánicos controló la proliferación de enterobacterias a las 29 semanas de edad. Adicionar el fitogénico en las dietas de gallinas Dekalb Brown puede ser una estrategia para mejorar la salud intestinal de las gallinas durante la postura. Palabras clave: bactericida, fitogénico, gallinas, salud intestinal ABSTRACT The quality of the eggs of laying hens produced on the farms is directly linked to a series of care in the handling, health and feeding of the birds. For the results to meet the expectations of the producer, it is important to consider the factors that directly impact the profitability of the activity. The objective of investigation was to determine the effect of a phytogenic bactericide, organic acids and a chemical bactericide on intestinal health in laying hens between 18 and 29 weeks of age. In total 144 Dekalb Brown hens were used considering 4 treatments (T1-control diet (DC) without additives, T2-DC with organic acids; T3-DC with phytogenic and T4-DC with chemical bactericide), divided into 6 replications with 6 hens per cage. At 18 and 29 weeks of age, the intestines of 2 hens were extracted for each repetition to evaluate the macroscopic characteristics, intestinal villi / Lieberkühn crypt ratio and the amount of enterobacteria in the intestine. Microscopically, the small intestine was evaluated according. There were no (p> 0.05) between the experimental treatments in the length of the villi and depth of crypts at 18 weeks of age, at 29 weeks statistics differences (p <0.05) of the group with phytogenic were found in the relationship between intestinal villi / crypts of Lieberkühn. The inclusion of phytogenic and organic acids controlled the proliferation of enterobacteria at 29 weeks of age. The use of phytogenics in Dekalb Brown hen diets may be a strategy to improve the intestinal health of hens during lay. Key words: bactericide, phytogenic, laying hens, intestinal health INTRODUCCIÓN La producción de huevos desempeña un papel importante dentro el sector pecuario; al ser considerado como uno de los principales subproductos del sector avícola, siendo una fuente principal de proteína animal (Sánchez. 2016). Hoy en día, la mayoría de los huevos que se comercializan provienen de gallinas ponedoras criadas en un sistema de confinamiento intensivo, modelo en el que las aves se alojan en jaulas dentro de los galpones a lo largo de su vida productiva (MIDAGRI, 2019). El Ministerio de Agricultura y Riego (2019) sostuvo que, en el 2019, el sector avícola representó el 26.8% (ave de consumo, 22.2% y huevos de gallina, 4.8%) del valor bruto de Producción Agropecuaria. Dentro de las estadísticas tenemos que los departamentos que aportaron más a la producción de huevos comerciales fueron Ica (39.5%), Lima (27.0%), La Libertad (18.9%), Arequipa (3.6%), San Martin (2.8%). El sector avícola es de gran importancia en el país , es por ello, que es fundamental garantizar las buenas prácticas en la crianza para asegurar una óptima producción y mayor cantidad de ingresos para dicho sector (Sánchez, 2016). La salud digestiva en la crianza de las aves es un factor muy importante, ya que, en el sistema digestivo se pueden iniciar la mayor cantidad de enfermedades y podrían repercutir no solo en este sistema sino en la salud de las aves. (Balamurugan y Chandrasekaran, 2011). Se considera que la colonia de bacterias en cada ave es individual y se desarrolla desde la eclosión del huevo, siendo las primeras bacterias presentes en la microbiota del polluelo son heredadas de los padres. Vivimos rodeados de bacterias, y el sistema digestivo no es la excepción. El microbioma intestinal está compuesto de más de 1012 bacterias y otros agentes como virus y hongos que habitan en el tracto intestinal de las aves siendo considerado como un órgano más importante para mantener el equilibro de la integridad intestinal y mejorar el rendimiento de las aves. Se considera que el microbioma podría contarse como un órgano más debido a su complejidad y al manipularlo podríamos contrarrestar muchas enfermedades polimicrobianas (Carter, 2018; Doughman, 2021). Hoy en día se tienen alternativas para promover la salud digestiva y mantener el equilibrio en la microbiota intestinal; elementos como nutrientes, prebióticos o prebióticos son los principales (Sharma et.al ,2020). Se ha sustituido a los antibióticos usados antiguamente como la alternativa para la mayoría de las enfermedades digestivas que, se encontró evidencia de resistencia antibiótica en los animales y consumidores. Por ello, es que se ha optado por enriquecer y mantener la microbiota intestinal de manera equilibrada bajo una buena alimentación y un correcto manejo ambiental de las aves (Doughman, 2021). Los compuestos fitogénicos son compuestos bioactivos volátiles o no volátiles a base de hierbas y especias como, los polifenoles, los ácidos orgánicos, aceites esenciales, entre otros, a los que se les atribuye propiedades como mejorar el rendimiento de la postura, la calidad del huevo y a nivel intestinal mejora el tránsito y permeabilidad para la absorción de micronutrientes a nivel del intestino delgado (Sharma et al, 2020). El tomillo (Thimus vulgaris) es una planta aromática muy conocida por la industria farmacéutica, ya que en su composición cuenta con isómeros como el carvacrol y el timol aportan propiedades como antioxidante, antifúngico y antibacteriano. El timol también se utiliza como un modulador de la microbiota intestinal, ya que, minimiza la proliferación de bacterias patógenas indeseables (Lahlou et al, 2021). El anillo de cimenol es una estructura presente en el tomillo, que al contacto directo con la bacteria produce una perforación en la membrana gracias a su polaridad y permeabilidad a la bicapa lipídica que genera que el contenido de la misma sea expulsado al exterior causando una muerte inmediata, ya que, en el medio intracelular, este anillo genera cambios dentro de los procesos metabólicos que involucran al ATP, que es responsable de brindar energía a la célula, así como también afecta al pH celular y al balance de iones inorgánicos (Vals, 2017; Sendra, 2011). Los ácidos orgánicos a su vez son compuestos carbonados provenientes de animales, plantas y microorganismos en la naturaleza. Se conoce que existen más de 60 clases estos, entre ellos se encuentran el ácido cítrico, ácido fórmico, ácido fumárico, entre otros (Park et al., 2009). Tienen como principales propiedades cambiar el pH a nivel intestinal ayudando a la absorción al incrementar la actividad de las enzimas digestivas y la utilización de minerales, conservando la morfología y el balance de la microbiota intestinal evitando la proliferación de patógenos, así como también ayuda a mejorar el sistema inmune (Kazempour y Jahanian, 2017; Wang et al, 2019). El formaldehido es una sustancia química que se obtiene por la oxidación catalítica del alcohol metílico. Este al ser un producto de bajo costo y versátil se ha utilizado por años por muchas industrias, ya que, posee una gran capacidad de polimerización y formación de nuevas sustancias (Astros y Combariza, 2019; Villareal, 2020). Tiene propiedades antifúngicas y antibacterianas, por ello, se utiliza en el sector pecuario para conservar el pienso, desinfección de instalaciones y como modulador de la microbiota intestinal en animales de producción. Tiene un amplio espectro para las principales bacterias patógenas como el Campilobacter sp., E. coli, Salmonella spp, entre otros (Rodriguez et al., 2012). En la Unión Europea, según el reglamento n°1831/2003, prohibieron su utilización como aditivo alimenticio animal que pertenece a los grupos de conservantes y los potenciadores en condiciones higiénicas. (Diario Oficial de la Unión Europea, 2003). Es por ello, que en la presente investigación se busca determinar el efecto de un bactericida fitogénico, ácidos orgánicos y bactericida químico con respecto a la salud intestinal y el equilibrio en el microbioma de gallinas de postura comercial. Se evaluó tanto la carga bacteriana mediante la metodología de cultivo bacteriano y conteo de colonias, así como también la integridad intestinal mediante la evaluación microscópica y macroscópica del tracto digestivo. MATERIALES Y MÉTODOS El presente estudio se realizó en la Unidad Avícola de Gallinas de Postura de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Científica del Sur. Es importante señalar que las instalaciones, así como el manejo diario en la granja, respetaron las normas vigentes establecidas por Humane Farm Animal Care. Los procedimientos de manejo y obtención de muestras fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Científica del Sur (Constancia N°149-CIEI-AB- CIENTÍFICA-2020). Animales experimentales Se utilizaron 144 pollonas de la línea Dekalb Brown, con peso promedio de 1350 ± 30 g y con buen estado de salud, donde se obtuvieron las pollonas con pesos esperados en la guía de manejo de la línea genética, considerando una uniformidad del 87.5%. Las pollonas llegaron despicadas y vacunadas contra Marek, Gumboro, New Castle, Bronquitis infecciosa, Laringotraqueitis, Coriza infecciosa y Encefalomielitis Aviar. Durante el experimento no se aplicaron vacunas. Previo al inicio del estudio las pollonas a las 15 semanas de edad fueron colocadas en jaulas de alambre galvanizado de 63 cm de ancho y 54 cm de profundidad, cada jaula contó con 2 bebederos tipo niple, un comedero horizontal, una rampa para recibir los huevos. Las pollonas fueron adaptadas al nuevo ambiente por 3 semanas, donde se brindó la una dieta estándar con todos los requerimientos nutricionales para la etapa de pre-postura de acuerdo con las recomendaciones nutricionales de Rostagno et al., (2017) y se controló diariamente la temperatura, humedad y luminosidad. Se mantuvo el programa de luz de la granja de procedencia que establecía 10 horas de luz natural, esto se mantuvo hasta las 16 y 17 semanas de edad (23 lux), manejando las cortinas y evaluando la luminosidad en 3 puntos del galpón parte anterior, medio y posterior. A las 18 semanas de edad cuando comenzó el experimento hasta las 29 semanas de edad se brindó de 30 lux de intensidad de luz y se fue aumentando poco a poco el programa de luz de acuerdo con las recomendaciones de la casa genética hasta llegar a 15 horas de luz a las 29 semanas de edad. Las gallinas fueron reagrupadas a las 18 semanas mediante un diseño completamente al azar de 4 tratamientos con 6 repeticiones y 6 gallinas en cada repetición. Cada repetición fue considerada como una jaula. Los tratamientos fueron; tratamiento 1: dieta control (DC) sin aditivos, tratamiento 2: DC + ácidos orgánicos, tratamiento 3: DC + bactericida fitogénico y el tratamiento 4: DC + compuesto químico. El alimento brindado en promedio fue de 121 g (10% a lo señalado por la guía de manejo) y el agua fue brindado ad libitum. Se utilizó un termohigrómetro digital (Westminster, modelo CX301C) se registró diariamente (2 veces al día) en tres puntos del galpón la temperatura y humedad y la luminosidad con el uso de un luxómetro (Control Company, modelo SKU: CC3252). Los huevos fueron recogidos 2 veces al día (mañana; 8:00 a.m y tarde; 5:00 p.m), siendo pesados en una balanza electrónica con capacidad de 40 kg y graduación de 2 g (marca Accura, modelo SAP-110). La morbilidad y mortalidad fue registrada diariamente. Dietas y aditivos experimentales Las dietas utilizadas fueron formuladas con características isoenergéticas e isoprotéicas (cuadro 1), de acuerdo a las recomendaciones nutricionales de la guía de manejo y Rostagno et al., (2017). Los aditivos del estudio fueron incluidos dentro de las dietas siguiendo las recomendaciones del fabricante y balanceando las dietas para que todos los tratamientos tengan valores similares de proteína, energía metabolizable, macrominerales (calcio y fósforo) y microminerales. Se utilizaron aditivos comerciales, registrados en el Servicio Nacional de Sanidad Agraria del Perú. Para el tratamiento 2 se empleó el acidificante en polvo, que consistió en una mezcla de ácidos orgánicos (ácido fosfórico, cítrico, acético, fumárico, tartárico y propilenglicol) a inclusión de 1 kg/tm. En el tratamiento 3, se adicionó el aditivo fitogénico comercial en polvo (Alquermold Natural, Biovet S.A, España, Registro SENASA: A.13.91.I.0155) compuesto por 300 g de anillo de cimenol proveniente del tomillo (Thymus vulgaris) y 100 g de ácido cítrico (E:330) y 1000 g de excipiente c.s.p, a inclusión de 0.5 kg/tm de alimento. Mientras que, para el tratamiento 4, se adicionó mediante aspersión el bactericida químico comercial líquido, compuesto de formaldehido (33%) y ácido propiónico a 1Lt/tm de alimento. La inclusión de del bactericida químico se hizo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante tomado las medidas de bioseguridad respectiva, se adicionó el 50% del producto en el alimento, se procedió a mezclar y se adicionó lo restante, el alimento preparado antes de ser empacado en los sacos fue secado al medio ambiente por 1 hora, luego fue empacado y transportado. Cuadro 1. Dietas de postura utilizadas en gallinas ponedoras de 18 a 29 semanas de edad suplementadas con los 3 aditivos (ácido orgánico, fitogénico y químico) Ácido Composición (%) Control Orgánico Fitogénico Bactericida (%) (%) (%) Químico (%) Maíz 7.8% 57.297 57.297 57.297 57.297 Torta de soya 19.641 19.641 19.641 19.641 Sub producto de trigo 2.100 2.000 2.050 2.000 Soya integral 8.050 8.050 8.050 8.050 Carbonato de calcio grueso 6.000 6.000 6.000 6.000 Carbonato de calcio fino 3.188 3.188 3.188 3.188 Fosfato dicálcico 1.448 1.448 1.448 1.448 Aceite de soya 1.325 1.325 1.325 1.325 Sal común 0.343 0.343 0.343 0.343 Bicarbonato de sodio 0.150 0.150 0.150 0.150 DL-metionina 0.149 0.149 0.149 0.149 Cloruro colina 0.109 0.109 0.109 0.109 Secuestrante micotox 0.100 0.100 0.100 0.100 Premix vit+min* 0.100 0.100 0.100 0.100 Ácido orgánico 0.100 Fitogénico 0.050 Bactericida químico 0.100 Composición nutricional Energía metabolizable (kcal/kg) 2800.002 2800.000 2800.000 2800.000 Proteína (%) 18.00 17.63 17.61 17.59 Calcio (%) 3.91 3.90 3.89 3.90 Extracto etéreo (%) 5.31 5.31 5.31 5.31 Fosforo total (%) 0.60 0.60 0.60 0.60 Potasio (%) 0.70 0.70 0.70 0.70 Sodio (%) 0.20 0.20 0.20 0.20 *Premix vitaminas y minerales: Retinol (Vitamina A) 13 000 000 UI; Colecalciferol (Vitamina D3) 3 500 000 UI; DL Alfa Tocoferol Acetato (Vitamina E) 30 000 UI; Menadiona Bisulfito (Vitamina K3) 3 g; Tiamina (Vitamina B1) 2.5 g; Riboflavina (Vitamina B2) 12 g; Piridoxina (Vitamina B6) 7 g; Cianocobalamina (Vitamina B12) 0.015 g; Ácido Pantoténico (Vitamina B5) 13 g; Ácido Fólico (Vitamina B9) 1.5 g; Niacina (Vitamina B3) 40 g; Biotina (Vitamina B7) 0.2 g; Manganeso 80 g; Zinc 80 g; Hierro 40 g; Cobre 8 g; Yodo 1.5 g; Selenio 0.3 g; Cobalto 0.2 g; Excipientes c.s.p. 1 kg. Evaluación de segmentos intestinales Para determinar la salud intestinal se realizó el análisis macroscópico, el análisis de la histológico y microbiológico del intestino a las 18 y 29 semanas de edad. Dos gallinas por cada repetición fueron sacrificadas por dislocación cervical a las 18 semanas de edad (inicio de postura) y a las 29 semanas de edad (pico de postura). Las gallinas tuvieron 2 horas de ayuno previas al sacrificio. Se expuso la cavidad abdominal y con sumo cuidado los intestinos fueron retirados y colocados en una bandeja, se procedió a identificar y delimitar los segmentos intestinales. Para el análisis histológico se tomó una gallina por repetición y se siguió la metodología de Xia et al. (2004) y Hu et al. (2012) donde en cada segmento intestinal se realizaron 3 cortes transversales de 1 cm aproximadamente, los cuales se lavaron con solución salina y se empacaron en formalina al 10%, deshidrataron a través de alcoholes graduados y se embebieron en parafina y con la ayuda de un micrótomo se realizaron los cortes histológicos de 4 µm de espesor, se confeccionó por cada segmento intestinal 3 láminas, se procedió a teñir las láminas con hematoxilina y eosina. En cada evaluación se determinó la altura de las vellosidades intestinales (desde la base de la vellosidad hasta el ápice con objetivo 40x), la profundidad de las criptas intestinales (diámetro de la glándula de Lieberkühn con un objetivo 40x) y la relación entre la altura de vellosidades y profundidad de criptas. La lectura de las láminas se realizó usando un microscopio electrónico (Nikon Corporation, modelo Nikon Eclipse E 200) que contenía control de cámara Nikon Digital Sight DS-L3. Se tomaron adicionalmente 3 mediciones de cada lámina obteniéndose un promedio de estas. En la misma exploración se identificó las características de la mucosa intestinal del segmento histológico utilizando la metodología modificada de Bracarense et al. (2012), donde se evaluó visualmente a mucosa del intestino considerando 3 grados de lesión variando de 0 a 3, siendo los grados; grado 0: sin cambios, mucosa intacta; grado 1: lesión leve de daño en mucosa (extensión 25%,1/3 del corte histológico); grado 2: lesión moderada (extensión 50%, mitad del corte histológico), y; grado 3: lesión severa (75 a 100% de extensión, ¾ de lesión del corte histológico o todo el corte histológico). En base a esto se identificó la dilatación de vellosidades asociada a enteritis granulocítica crónica segmentaria (linfocitos y eosinófilos), edema intersticial de vellosidad, con la lámina propia circundante edematosa y la punta de las vellosidades distendida (Dossin y Lavoué, 2011) y la hipoplasia de células caliciformes, cuya diferenciación se denota por presencia de células caliciformes estrechas en parte superior con tinción basófila. En el análisis microbiológico se sacrificó una gallina por cada repetición de tratamiento. En una cabina de flujo laminar se realizó la colecta en triplicado de contenido de mucosa intestinal (1 g aproximadamente por cada colecta) utilizando un hisopo estéril se procedió a colectar una muestra de la segunda asa duodenal esto para determinar E. coli y Salmonella y a nivel del yeyuno también se extrajo mediante un hisopo estéril una muestra de contenido para evaluar si existe o no presencia de Clostridium spp. y a nivel de los ciegos se realizó la colecta para el análisis de Campilobacter. Dicho procedimiento se llevó a cabo en el laboratorio Alfabiol, en el caso de E.coli, Salmonella spp., y Clostridium spp. Se consideró como ave positiva a la presencia de bacterias aquellas que presentaban más de 10 UFC por gramo de muestra. Análisis estadístico Las variables de histología intestinal fueron analizadas mediante el diseño completamente aleatorio en dos etapas: 18 y 29 semanas de edad. Se realizó el análisis de normalidad con la prueba de Shapiro Wilk. En el programa Stata (2017) se realizó el Análisis de Varianza con un nivel de significancia de 5% y los tratamientos se compararon utilizando la prueba Tukey con un nivel de significancia del 5%. RESULTADOS Evaluación microscópica de los segmentos intestinales A las 18 semanas de edad las aves de todos los tratamientos presentaron una mucosa intestinal intacta, mientras que a las 29 semanas de edad se evidenció que las gallinas suplementadas con el bactericida químico presentaron más lesiones a nivel del epitelio intestinal, con lesiones de grado 2 y 3 comparado con los otros tratamientos. Tanto el tratamiento control como el fitogénico tuvieron menores cambios en el epitelio. (Cuadro 2). Cuadro 2. Clasificación de lesiones microscópicas en mucosa del intestino delgado de gallinas Deklab Brown suplementadas con diferentes aditivos comerciales Tratamientos Lesiones en intestino y grado de Ácido Bactericida severidad Control Fitogénico Orgánico químico 18 semanas Mucosa intacta 100% (G0) 100% (G0) 100% (G0) 100% (G0) Dilatación de vellosidades 100% (G0) 100% (G0) 16.7% (G1) 100% (G0) Edema intersticial de vellosidad 100% (G0) 100% (G2) 100% (G0) 16.7% (G1) Hipoplasia de células caliciformes 100% (G0) 100% (G0) 100% (G0) 100% (G0) 29 semanas Mucosa intacta 100% (G0) 100% (G0) 100% (G0) 50% (G2) Dilatación de vellosidades 16.7% (G1) 100% (G0) 100% (G0) 50% (G2) Edema intersticial de vellosidad 16.7% (G1) 16.7% (G1) 100% (G0) 83.3% (G3) Hipoplasia de células caliciformes 100% (G0) 16.7% (G1) 100% (G0) 66.7% (G3) Adaptado de Bracarense et al., (2012). N: 6 gallinas por tratamiento Grado de lesión, G0: sin lesiones aparentes (0%), G1: lesión leve (25%), G2: lesión moderada (50%), G3: lesión severa (75%). Evaluación histológica de los segmentos intestinales No se evidenció diferencias estadísticas (p > 0.05) en la longitud de vellosidades intestinales, profundidad de criptas y la relación entre vellosidad/cripta a las 18 semanas (Cuadro 3). Sin embargo, a las 29 semanas, se evidenció diferencias estadísticas (p < 0.05) entre sus promedios respecto a longitud de vellosidades en el duodeno, siendo mayor en el T3 (fitogénico) con una longitud de 928.96 µm, seguido por el tratamiento de ácidos orgánicos con 912.75 µm. De igual manera, se puede apreciar que la relación vellosidad/cripta en el mismo segmento, evidenció una diferencia estadística (p < 0.05) a favor del tratamiento con fitogénico, este mismo resultado fue observado en el íleon, siendo el T3 el que presentó mayor relación (p < 0.05) vellosidad/cripta. Cuadro 3. Longitud de vellosidad intestinal (µm), profundidad de cripta de Lieberkuhn (µm) y relación vellosidad/cripta en gallinas Deklab Brown suplementadas con diferentes aditivos comerciales Tratamientos Indicador Ácido Bactericida EE P - Valor Control Fitogénico Orgánico químico 18 semanas Duodeno Longitud de vellosidad 611.25 619.21 617.42 614.24 13.24 0.113 Profundidad criptas 66.05 68.67 66.88 68.44 2.09 0.057 Relación vellosidad/cripta 9.25 9.02 9.23 8.97 0.064 0.051 Yeyuno Longitud de vellosidad 700.53 702.89 705.1 699.52 13.06 0.062 Profundidad criptas 78.42 77.76 78.07 77.61 4.34 0.054 Relación vellosidad/cripta 8.93 9.04 9.03 9.01 0.95 0.057 Íleon Longitud de vellosidad 799.53 808.35 806.16 797.52 11.281 1.023 Profundidad criptas 82.99 83.91 84.12 82.98 2.031 0.089 Relación vellosidad/cripta 9.63 9.63 9.58 9.61 0.982 0.051 29 semanas Duodeno Longitud de vellosidad 873.15b 912.75a 928.96a 851.14b 14.12 0.013 Profundidad criptas 85.64ab 82.94b 77.15c 89.63a 2.04 0.001 Relación vellosidad/cripta 10.20c 11.00b 12.04a 9.50d 0.87 <0.001 Yeyuno Longitud de vellosidad 960.64 971.94 998.15 948.63 12.56 0.056 Profundidad criptas 89.75b 83.98b 77.19c 94.94a 2.75 0.008 Relación vellosidad/cripta 10.70b 11.57b 12.93a 9.99c 0.89 0.001 Íleon Longitud de vellosidad 1022.73b 1097.54b 1170.96a 1000.72c 11.54 0.017 Profundidad criptas 92.28a 89.60b 82.81c 96.27a 1.96 0.001 Relación vellosidad/cripta 11.08c 12.25b 14.14a 10.39d 0.97 <0.001 *EEM: Error estándar de la media N: 6 gallinas por tratamiento abcLetras diferentes indican diferencias significativas a la prueba de Tukey (p < 0.05). Evaluación microbiológica intestinal No se evidenció presencia de Salmonella spp. y Campilobacter spp. a las 18 y 29 semanas de edad. A las 18 semanas de edad se observó que el 50 y 33.3% de E. Coli. y Clostridium spp., respectivamente, tanto para el control, suplementado con ácidos orgánicos y fitogénico (Cuadro 4). Mientras que en el grupo de gallinas con la dieta de formaldehido se encontró que el 66.7% presentaron E. Coli y 16.7% presentaron Clostridium spp. A las 29 semanas de edad el grupo control presentó 5 de 6 gallinas equivalente al 83.3% (5/6) tuvieron E. Coli, 50.0% (3/6) presentaron Clostridium spp. y el 33.3% (2/6) presentaron Campilobacter spp. Las gallinas suplementadas con ácidos orgánicos evidenciaron 33.3 (2/6) y 16.7% (1/6) E. Coli y Clostridium spp., respectivamente. En el grupo con fitogénico sólo se observó que una (1/6; 16.7%) gallina presentó más de 10 UFC de E. Coli /g de muestra. Las gallinas del tratamiento con bactericida químico presentaron 66.7 (4/6) de E. Coli, 50.0% (3/6) de Clostridium spp. y 33.3% (2/6) Campilobacter spp. Cuadro 4. Porcentaje de presencia de enterobacterias en gallinas Deklab Brown suplementadas con diferentes aditivos comerciales 18 semanas de edad Clostridium Campilobacter Tratamientos Salmonella sp. E. Coli spp. spp. Control (0/6) 0.0% (3/6) 50.0% (2/6) 33.3% (0/6) 0.0% Ácido orgánico (0/6) 0.0% (3/6) 50.0% (2/6) 33.3% (0/6) 0.0% Fitogénico (0/6) 0.0% (3/6) 50.0% (2/6) 33.3% (0/6) 0.0% Bactericida Químico (0/6) 0.0% (4/6) 66.7% (1/6) 16.7% (0/6) 0.0% 29 semanas de edad Clostridium Campilobacter Tratamientos Salmonella sp. E. Coli spp. spp. Control (0/6) 0.0% (5/6) 83.3% (3/6) 50.0% (2/6) 33.3% Ácido orgánico (0/6) 0.0% (2/6) 33.3% (1/6) 16.7% (0/6) 0.0% Fitogénico (0/6) 0.0% (1/6) 16.7% (0/6) 0.0% (0/6) 0.0% Bactericida Químico (0/6) 0.0% (4/6) 66.7% (3/6) 50.0% (2/6) 33.3% N: 6 gallinas por tratamiento DISCUSIÓN Debido a la intensa producción en la avicultura comercial, continuamente las gallinas están expuestas a diferentes desafíos sanitarios que pueden afectar su salud. El periodo de inicio de postura y pico de postura puede ser un periodo estresante para las gallinas puesto que aún ellas están creciendo, mientras comienzan a producir los huevos, adicionalmente hay una transición del levante a la postura donde deben adaptarse al transporte, a una nueva dieta, a un nuevo programa de luz, todo esto puede llevar a que se produzca un balance negativo de nutrientes afectando su desempeño, pudiendo tener efectos sobre su salud y alterar el funcionamiento del intestino para absorber los nutrientes (Chávez et al, 2015; Oviedo-Rondón, 2019). Así, posibles inferencias con respecto al tipo de aditivo utilizado en el presente estudio pueden estar relacionados inicialmente con eficiencia de estos aditivos para mejorar las características del intestino. A nivel histológico se observó que todas las aves evaluadas a las 18 semanas de edad no presentaron alteraciones a nivel de la mucosa intestinal; sin embargo, a las 29 semanas de edad las aves que recibieron el bactericida químico presentaron edema intersticial de vellosidad e hipoplasia de células caliciformes, de este modo es posible que debido a la irritación causada por este a nivel intestinal hubiera acumulación de fluidos en la mucosa y submucosa del intestino por posible ruptura de los vasos sanguíneos, así, la hipoplasia de las células caliciformes podría estar relacionada a una menor producción de mucina (Foong y Bornstein, 2009). Por otro lado, se menciona que, al utilizarlo en el agua de bebida en pollos de engorde, no se evidenciaron cambios tanto a nivel macroscópico como a nivel histológico (Rodriguez et al, 2012). A las 29 semanas de edad, las gallinas suplementadas con el fitogénico, seguido del ácido orgánico presentaron una mayor longitud de vellosidades intestinales y menor profundidad de criptas en diferencia de los otros. En cuanto a la relación entre la vellosidad y profundidad de criptas se verificó que hubo un aumento de esta variable con el uso de los fitogénicos, en los 3 segmentos intestinales. La presencia de aditivos en la dieta mantuvo o incluso aumentó el número de vellosidades/área en los segmentos de mayor absorción intestinal. Al igual que, Demir et al. (2003) al estudiar la sustitución de antibióticos por diferentes aditivos fitogénicos, en pollo de engorde, observaron una menor profundidad de las criptas en el íleon (p <0.05) en los que recibieron el timol. Por otra parte, Farahat et al. (2021) al utilizar productos a base de extractos de plantas para la alimentación de pollos broiler machos Ross-308 encontró variaciones estadísticas (p<0.05) en las vellosidades intestinales tanto en el duodeno, yeyuno e íleon aumentando su crecimiento en un 38, 23 y 21% respectivamente; para la profundidad de criptas se obtuvo diferencia estadística para el segmento duodenal con un 42% de cambio en las dietas con estos aditivos en concentraciones de 500, 1000, 2000 mg/kg de alimento. Como consecuencia se obtuvo que la relación entre la longitud de las vellosidades y la profundidad de criptas tuvo un incremento (p<0.01) de 138, 52 y 41% en el duodeno, yeyuno e íleon respectivamente en dietas con 500 y 1000 mg/kg de compuestos fitogénicos en el alimento, que al igual que en el presente experimento. Por otra parte, se observó que a nivel microbiológico a las 29 semanas de edad las gallinas suplementadas con ácidos orgánicos y el producto fitogénico tuvieron menor presencia de bacterias a nivel intestinal, esto posiblemente pudo estar asociado al mantenimiento de la integridad intestinal relacionado con el mantenimiento de las células caliciformes productores de mucina para mejorar la barrera contra patógenos (Foong y Bornstein, 2009). De forma normal existen bacterias que pueden llegar al intestino atravesando la mucosa intestinal y de esta manera pueden interactuar con las mucinas lo que puede desencadenar una respuesta en el intestino, las mucinas actuarían no solo como una barrera para los patógenos si no, que también envían señales al intestino para una mayor secreción de las mismas y desencadenan otras respuestas de defensa (Pelaseyed et al., 2014), así, cuando hay alteraciones de la mucosa intestinal esta mucina puede verse alterada sin poder evitar la proliferación de patógenos como en las aves suplementadas con el bactericida químico. Adicionalmente, en las gallinas suplementadas con fitogénicos y ácidos orgánicos al tener un intestino saludable, pudo existir mayor producción de IgA que fue secretada por las células plasmáticas en la lámina propia (Ju et al., 2009) brindando protección contra patógenos invasores, neutralizando bacterias patógenas y controlando comensales (Montilla et al., 2004; Santaolalla y Abreu, 2012). Kazempour y Jahanian (2017) evaluar la microbiota a nivel del íleon en aves de postura con dietas deficientes de fósforo, esta no fue alterada por la baja composición de fósforo, pero sí tuvo efectos significativos al ser suplementados con ácidos orgánicos (p<0.05). La concentración de Salmonella fue reducida (p<0.01) con la dieta que contenía todos los ácidos orgánicos suplementados. Asi mismo, Emami et al. (2017), al estudiar un grupo de pollos desafiados con E. coli K88 a las que suplementaron con ácidos orgánicos comerciales encontró en evaluación microbiológica cecal que los animales suplementados con ácidos orgánicos a los 10 días de edad redujeron la carga de E. coli cecal en comparación de los pollos desafiados con E.coli K88 (p<0.05). A los 35 días de edad, los grupos suplementados con ácidos orgánicos tenían una concentración cecal de E. coli más baja. Mientras que, Campigotto et al. (2021) utilizaron una mezcla de compuestos fitogénicos como el timol, carvacrol y cinamaldehído para producir un alimento para perros y determinar el impacto de este aditivo en la salud animal y la microbiota intestinal. Halló que los animales que se alimentaban con la dieta que contenía el aditivo a los días 30 y 45 días del experimento tuvieron recuentos de colonias bacterianas total y recuento de coliformes (p<0.05) más bajos y en el de Salmonella spp. (p<0.01) en las heces. Reis et al. (2018), por otro lado, tuvo como grupo de estudio pollos a las que se le evidenció que al realizar un recuento bacteriano total se muestra una diferencia estadística (p<0.05) en los pollos suplementados con 1.0% del compuesto a los 42 días de edad. CONCLUSIÓN Se concluyó que, el tratamiento con bactericida fitogénico genera menores cambios en la longitud de las vellosidades intestinales y la profundidad de las criptas en los diferentes segmentos del tracto digestivo, así como también ayuda a mantener en equilibrio la cantidad de carga bacteriana de los agentes bacterianos como Clostridium sp, E. coli, Salmonella sp, Campylobacter sp, presentes en el tracto digestivo de las aves de postura. El tratamiento con ácidos orgánicos tuvo resultados similares a los presentados con el bactericida fitogénico siendo beneficioso para las gallinas, mientras que el que presentaba el bactericida químico generó más daños a nivel de la mucosa intestinal y mayor presencia de agentes bacterianos siendo el tratamiento menos favorable para las gallinas. LITERATURA CITADA 1. Balamurugan R, y Chandrasekaran K. 2011. Effects of Multi-enzyme Supplementation on Gut Morphology and Histomorphology in Broilers. Indian J Sci And Technol. Vol.4(1): 15- 18. 2. Bracarense APF, Lucioli J, Grenier B, Pacheco G D, Moll WD, Schatzmayr G, Oswald IP. 2012. Chronic ingestion of deoxynivalenol and fumonisin, alone or in interaction, induces morphological and immunological changes in the intestine of piglets. British Journal of Nutrition, 107(12): Campigo1776-1786 3. Campigotto G., Jaguezeski A., Alba D., Giombelli L., Da Rosa G., Souza C., Baldissera M., Petrolli T., Da Silva A. 2021. 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