FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y BIOLÓGICAS CARRERA PROFESIONAL DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA “DISEÑO Y VALIDACIÓN DE PRIMERS PARA EL GEN CALMEGIN (CLGN) EN ALPACAS” Tesis para optar el título profesional de: MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA Presentado por: Luciana Ganoza Reyes (0000-0003-0655-6299) Asesor: Shirley Sujey Evangelista Vargas (0000-0001-6105-1889) Lima – Perú 2020 DISEÑO Y VALIDACIÓN DE PRIMERS PARA EL GEN CALMEGIN (CLGN) EN ALPACAS DESIGN AND VALIDATION OF PRIMERS FOR THE GENE CALMEGIN (CLGN) IN ALPACA Luciana Ganoza Reyes 1, Shirley Sujey Evangelista Vargas1, 2 RESUMEN Calmegin es un gen de importancia reproductiva por expresar una proteína que tiene por función ayudar en el plegamiento, ensamblaje y transporte celular de un gran rango de proteínas responsables de la migración normal del espermatozoide desde el útero hasta el oviducto, por la afinidad a uniones de iones de calcio, y la adhesión espermática al ovocito. Por lo tanto, el objetivo de esta investigación fue diseñar y validar primers para el gen Calmegin en alpacas. Los primers se diseñaron utilizando el programa bioinformático Primer3 y para el análisis de subproductos se empleó el programa Oligoanalizer Tool. Se diseñaron dos pares de primers, CG1 (397 pb) y CG2 (321 pb). Para la validación de los primers diseñados, se extrajo ADN de 20 muestras de tejido testicular de alpaca obtenidos del Camal Municipal de Huancavelica, estas muestras se amplificaron mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) convencional y los productos fueron visualizados mediante electroforesis horizontal con gel agarosa al 1.2%, en el Laboratorio de Biotecnología Reproductiva y Celular de UCSUR. Las bandas observadas coinciden con el tamaño de amplicón propuesto por el programa Primer3. Se concluyó que, es posible diseñar primers in silico para el gen de Calmegin en alpaca y validarlos mediante la técnica de PCR. Palabras clave: Diseño de primers, calmegin, alpaca. ABSTRACT Calmegin is a gene of reproductive importance because it expresses a protein whose function is to help in the folding, assembly and cellular transport of a wide range of proteins responsible for the normal migration of sperm from the uterus to the oviduct, due to the affinity to calcium ion bonds, and sperm adhesion to the oocyte. Therefore, the aims of this study were to design and validate primers for Calmegin gene in alpacas. The primers were designed using the bioinformatic program Primer3 and the Oligoanalizer Tool program was used for by-product analysis. Two pairs of primers were designed, CG1 (397 pb) and CG2 (321 pb). For the validation of the designed primers, DNA was extracted from 20 alpaca testicular tissue samples obtained from the Camal Municipal de Huancavelica, these samples were amplified using the conventional Polymerase Chain Reaction (PCR) technique and the products were visualized by horizontal gel electrophoresis with 1.2% agarose, in the Laboratory of Reproductive and Cellular Biotechnology from UCSUR. The observed bands coincide with the amplicon size proposed by the Primer 3 program. It was concluded that it is possible to design in silico primers for the Calmegin gene in alpacas and validate them using the PCR technique. Key words: Primer design, calmegin, alpaca 1 Laboratorio de Biotecnología Reproductiva y Celular, Facultad de Ciencias Veterinarias y Biológicas, Universidad Científica del Sur, Lima, Perú 2 Email: sevangelista@cientifica.edu.pe INTRODUCCIÓN El Perú es el país con mayor número de alpacas en el mundo, donde la crianza es una de las actividades principales que realizan los pobladores de las zonas altoandinas en un hábitat por encima de los 3.000 msnm, aprovechando de manera eficiente las áreas de praderas naturales para la producción de fibra y carne (Quispe et al., 2009). Se conoce que el 85% de las alpacas del país son criadas en un sistema tradicional, caracterizado por un bajo nivel tecnológico, que conlleva a bajos ingresos y a la disminución de la calidad genética de los animales (Huanca ,2012; Barrantes et al., 2018). Es por ello, que se han realizado proyectos de selección y mejora genética en esta especie; sin embargo, como parte de estos proyectos la selección de reproductores machos se enfoca únicamente en aspectos de conformación y calidad de fibra, lo cual genera que sea bastante frecuente encontrar machos infértiles o subfértiles en planteles de reproductores establecidos (García, 2005; Quispe et al., 2013). En producción animal en otras especies, el plantel de reproductores debe estar formado por machos genéticamente superiores, es por este motivo que lo recomendable sería que las alpacas que ingresen a un plantel de reproductores puedan contar con pruebas genómicas que nos permitan seleccionar a los animales genéticamente superiores en todo aspecto. (Jonas y Koning, 2015; Schefers y Weiges, 2012; Bouquet y Juga, 2013). Cabe resaltar que, la aplicación de herramientas de selección genética, permite un mejor entendimiento de la arquitectura de los caracteres y ofrece el uso sinérgico mediante métodos asistidos asegurar con precisión el progreso genético deseado de las características reproductivas (Parra y Sifuentes, 2012,). Esto se ha demostrado en especies de producción como los ovinos, caprinos y bovinos, en los cuales se han estudiado genes relacionados a diversas características productivas y reproductivas, siendo algunos de ellos los genes IZUMO1, CRISP 1, 2 y 3, TPST2, CALR3, Calmegin entre otros (Koppers et al., 2011; Muro y Okabe, 2011; Ledesma, 2018), en donde se ha demostrado la importancia de conocer la secuencia de los genes que expresan estas proteínas para ser usados como marcadores genéticos (López-Zavala, 2010). Los genes empleados para selección genómica no necesariamente están relacionados a la expresión de una única característica, ni una única característica reproductiva está regulada por la expresión de un único gen, en la mayoría de los casos hablamos de patrones genéticos, los cuales son grupos de genes que regulan un carácter, lo cual se observa en la mayoría de caracteres reproductivos (Pryce y Daetwyler, 2011). De todos los genes identificados como importantes en diversos procesos reproductivos (Ikawa, et al., 2011; Okabe, 2015), se ha demostrado que el gen Calmegin (Ikawa et al, 1997) es esencial para conferir la capacidad fecundante a los espermatozoides y se expresa mayormente en tejido testicular en mamíferos (Siep et al, 2004; Wang et al, 2004; Inoue et al, 2007). Este gen ha sido estudiado en muchas especies como: humanos, roedores, entre otros (Tanaka et al 1997; Ikawa et al, 2001; Yamagata et al, 2002; Muro y Okabe, 2011). Además, se ha determinado, que la ausencia total del gen produce esterilidad en ratones macho (Yamagata et al, 2002). El gen codifica una proteína denominada de la misma manera, que se localiza en la membrana del retículo endoplasmático, la cual se expresa durante la meiosis y la espermiogénesis, siendo dicha proteína de expresión especifica en los testículos (Yamagata et al, 2002, Ikawa et al, 2011). Calmegin juega un rol importante en el ensamblaje de proteinas fundamentales para la fecundación, tales como las ADAMs, lo cual fue demostrado en estudios realizados en ratones geneticamente modificados para carecer de calmegin (CLGN -/), en los cuales se llegó a observar la desaparición total de fertilina α/β y por consiguiente, la perdida de la capacidad fecundante (Yamagata et al, 2002, Ikawa et al, 2011, Muro & Okabe, 2011). Así mismo, se ha demostrado que la deficiencia de Calmegin no altera la morfología y motilidad normal de los espermatozoides, motivo por el cual se podría clasificar a los espermatozoides como aptos para fecundar a pesar de que son estériles (Ikawa et al., 2011, Inoue, et al., 2011; Mishra, et al., 2013; Lin, et al., 2015; Okabe, 2015). En alpacas no se han realizado estudios relacionados a la evaluación de la proteína o identificación específica del gen. En la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI por sus siglas en inglés), se almacena la secuencia completa del gen Calmegin (Gene ID: 102536054) ubicado en el cromosoma 2 entre el nucleótido 395295 y el 436791 con aproximadamente 41496 pares de bases (pb) sumado a esto, no existe información concreta sobre el desarrollo de primers para el gen en mención en alpacas. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo es diseñar primers para el gen Calmegin en alpacas y validarlos mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa convencional (PCR). MATERIALES Y MÉTODOS La secuencia nucleotídica del gen (Gene ID: 102536054) y la variante x2 de ARNm (Código acceso NCBI: NW_005882945.1) de Calmegin en alpacas se obtuvieron del GenBank del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/); las cuales fueron alineadas utilizando el programa Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Luego se diseñaron primers in silico empleando el software Primer 3 versión 0.4.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/), utilizando como base la secuencia del gen Calmegin en alpacas. A continuación, de las zonas seleccionadas, se tomaron fragmentos de aproximadamente 20kb, los cuales fueron ingresados al programa para generar primers (Forward y Reverse), seleccionando únicamente a aquellos que cumplían los criterios de inclusión establecidos por Abd-Elsalam (2003) mencionados en el Cuadro 1. También se evaluó la formación de subproductos de PCR in silico, mediante el programa gratuito Oligoanalizer 3.0 de Integrated DNA Technologies (IDT) (https://www.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer). Con este programa se logró obtener los valores de estabilidad termodinámica (Energía libre de Gibbs; ∆G°), formación de horquillas, formación de homodimeros y heterodímeros; todos estos valores nos ayudan a predecir posibles errores en las reacciones de PCR, es por ello que se evalúa si los primers cuentan con los parámetros mínimos deseables y de esta manera seleccionar aquellos que primers que pueden ser incluidos en el proceso de termociclación (Cuadro 2). Una vez seleccionados los primers ideales, se procedió a determinar la ubicación de estos con respecto a la secuencia del gen, para inferir en que exón o intrón se encontraban. Para ello se realizó el alineamiento in silico de los mismos con las secuencias trabajadas al inicio. Para el trabajo en laboratorio, se emplearon un total de 20 muestras de tejido testicular obtenidos de 10 individuos de alpacas beneficiadas en el camal municipal de Huancavelica, a los cuales se le retiró la túnica vaginal visceral y posteriormente se realizó un lavado con suero fisiológico al 0.9%. Cada par de testículos obtenido de cada individuo fue colocado en una bolsa plástica y fueron refrigeradas con suero fisiológico a 5°C para el transporte inmediato a Lima (Banda et al., 2010). La extracción del ADN se realizó en el laboratorio de Biotecnología Reproductiva y Celular de la Universidad Científica del Sur (Villa El Salvador, Lima). El procesamiento de los testículos se realizó de la siguiente manera, se extrajo un corte de 1cm3 de tejido testicular, usando material previamente esterilizado con radiación UV por 30 minutos, con el fin de eliminar ADNasas o contaminación con ADN externo. Luego se realizó la extracción de ADN, utilizando para ello el kit comercial innuPREP DNA Mini Kit (Analytik Jena AG). Mediante este kit se obtiene ADN generando la lisis de la membrana celular y nuclear para liberar el contenido, posteriormente es necesario realizar dos pasos de lavado para disminuir los contaminantes (ARN, proteínas, etc.) y en el último paso se disminuyó a la mitad el volumen de elución a diferencia de lo indicado por el manual para concentrar la muestra de ADN. A continuación, el ADN extraído se mezcló con el reactivo comercial InnuMIX standard PCR MasterMix (Analytik Jena AG) para preparar la PCR convencional. Para evidenciar que no se produjeron contaminaciones cruzadas o errores de manejo, se incluyó un control negativo sin ADN (blanco). La técnica se realizó en un termociclador Thermal Cycler 0.2ml x 64 PCR-300 (mcr), aplicando el siguiente protocolo 1 ciclo de desnaturalización inicial de 95 °C por dos minutos, una fase 2 de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 40 segundos, anillamiento 58 °C por 40 segundos, elongación a 72 °C por 40 segundos y finalmente una elongación final de 72 °C por 10 minutos como se observa en el Cuadro 3. Todos los productos de la PCR obtenidos se visualizaron utilizando la técnica de electroforesis en gel de agarosa, con una concentración de 1.2%. Se utilizó una cámara de electroforesis horizontal de 10 x 10 (ENDURO) y buffer de corrida TAE (Cleaver Scientific) a una concentración de 1x (10 ml de TAE + 490 ml de H20 destilada). Para la visualización de los fragmentos amplificados se empleó un buffer de tinción Safeview Classic (Applied Biological Materials Inc., Abm) y se utilizó un marcador de peso molecular comercial de 1 kb (InnuSTAR 1 kb DNA Ladder Express, Analytik Jena). En seguida, se realizó la corrida de electroforesis durante 40 minutos a 90 voltios. Finalmente, los geles obtenidos, se visualizaron en un analizador de imagen EnduroTM GDS. Cuadro 1: Cuadro de criterios de diseño de primers Criterio Descripción Tamaño Tamaño ideal: 20-25 nucleótidos de longitud Generalmente: 18-30 nucleótidos de longitud Base en el extremo 3’ Debe ser G o C Temperatura melting (Tm) 50-65 ºC Contenido %GC 40-60% Autocomplementaridad Debe ser evitada para minimizar la formación de estructuras secundarias y los dímeros de primer Similaridad Debe tener 100% de apareamiento con el molde Fuente: Abd-Elsalam, 2003. Cuadro 2: Cuadro de criterios de valores de estabilidad termodinámica. Subproductos Observaciones Horquillas • ΔG=0 → Está en equilibrio. • ΔG es + → La reacción no se va a dar espontáneamente. • ΔG es - → La reacción se va a dar espontáneamente Homodimeros (F+F O • Se busca que la ΔG este entre -1 a -10. R+R) • Si la ΔG es mayor de -10 puede ser un problema. Heterodímeros (F+R) Cuadro 3. Protocolo de termociclador PASO CICLO PERFIL TEMPERATURA TIEMPO 1 1 Desnaturalización 95 °C 2 minutos inicial 2 40 Desnaturalización 95 °C 40 segundos Anillamiento 58 °C 40 segundos Elongación 72 °C 40 segundos 3 1 Elongación final 72 °C 10 minutos RESULTADOS El diseño de primers se ejecutó empleando la secuencia de ADN del gen Calmegin en alpacas que se encuentra en la base de datos del NCBI, constituida de 41496 pb y 16 exones. Y se obtuvo un total de 20 pares de primers (Cuadro 4) diseñados mediante el programa primer 3. Mediante el alineamiento de las secuencias del gen Calmegin y ARNm fue posible determinar la ubicación de los exones dentro de la secuencia del gen. Cumpliendo con los criterios de selección de primers visto en el Cuadro 2, se seleccionaron un total de 20 pares de primers para el gen Calmegin en alpacas (Cuadro 4) de los diseñados mediante el programa primer 3, todos estos eran candidatos válidos para ser sintetizados. Se empleó un muestreo probabilístico al azar para seleccionar los dos mejores pares de primers, el 2 y 17 a los cuales se les denomino Calmegin-CG1 y Calmegin-CG2 respectivamente (Cuadro 5 y 6). Estos fueron sometidos a evaluación de predicción de estructuras secundarias (Cuadro 7) para determinar la calidad de los productos, donde se presentan los valores de estabilidad termodinámica (∆G°), de las interacciones entre cebadores: formación de horquillas, homodimeros y heterodímeros). En la pareja de primers visto se puede ver que pueden producirse heterodímeros más o menos estables con valores de estabilidad altos a diferentes temperaturas, es decir, con energía libre de Gibbs cercana a 0. Aparte todas las horquillas descritas de los primers seleccionados implican un riesgo a considerar en las reacciones de PCR por su cercanía a 0. Finalmente, estos fueron alineados con las secuencias anteriormente mencionadas, y se determinó que el primer forward de Calmegin-CG1 está ubicado entre los nucleótidos 40322 y 40342 tomando parte del exón 16 de la secuencia de Calmegin en alpacas; para el primer reverse de Calmegin-CG1 está entre los 40700 y 40720 del exón 16; y de igual manera, el primer forward de Calmegin-CG2 está entre los 28252 y 28272 del intrón 1 y para el primer reverse de Calmegin-CG2 está entre los 28553 y 28573 del intrón 1 (Figura 1-4). En la Figura 5 se observa los amplicones obtenido para el par de primers Calmegin-CG1. La Figura 6 corresponde a los amplicones del par de primers Calmegin- CG2. En ambos, el tamaño de los amplicones coincide con el tamaño de producto obtenido en el software Primer3, amplifico un producto comprendido entre los 300 y 400 pares de bases, siendo 397 pares de bases para el primer CG1 y 321 pares de bases para el primer CG2. El orden de los carriles está distribuido de igual forma en los dos geles, siendo la siguiente: Carril M: Marcador de peso molecular (1kb), Carril 1 y 2: amplicones de la muestra N° 1 de ADN, Carril 3 y 4: amplicones con muestra N°2 de ADN, Carril 5 y 6: amplicones con muestra N°3 de ADN, Carril 7: amplicones con muestra N°4 de ADN y, Carril 8: Blanco o control negativo (-); los carriles 2,4 y 6 se corrieron con el fin de demostrar la repetibilidad de la prueba. Cuadro 4. Secuencias y características de los primers diseñados mediante el programa Primer3 para el gen Calmegin en el genoma de la alpaca # Primer Secuencia (5’ A 3’) Longitud Tm %GC Ubicación Tamaño (ºC) de amplicón (pares de bases-pb) 1 Forward TTAAAGGGCACACGTTCTCA 20 59.32 45 Intrón 1 407 Reverse CCTCCAAATGCCATATCGTT 20 59.78 45 Intrón 1 2 Forward AGCACAGGATCTGGAGATGG 20 60.22 55 Exón 16 397 Reverse TTCTAACAGCGGTGAAGCTG 20 59.22 50 Exón 16 3 Forward GCTTTTAAAGGGCACACGTT 20 59.27 45 Intrón 1 411 Reverse CCTCCAAATGCCATATCGTT 20 59.78 45 Intrón 1 4 Forward CCTGTAAAACCAGCTCAGCA 20 59.07 50 Exón 11 451 Reverse CTGACTTGACTGGCCCATCT 20 60.26 55 Intrón 1 5 Forward GGCACAATTCCGGAAAATAG 20 59.41 45 Intrón 1 443 Reverse AAGCTGAGGTAGGCCCTCTC 20 59.98 60 Intrón 1 6 Forward AAAGCATTGAGCAACCGTCT 20 59.88 45 Intrón 1 426 Reverse GACCAGGCCTGAACAAAGTC 20 59.70 55 Intrón 1 7 Forward GGCACAATTCCGGAAAATAG 20 59.41 45 Intrón 1 448 Reverse ACAGCAAAGCTGAGGTAGGC 20 59.64 55 Intrón 1 8 Forward AAAGCATTGAGCAACCGTCT 20 59.88 45 Intron1 341 Reverse CCCCAAAATGTCCGGTACTA 20 59.68 50 Intrón 1 9 Forward AGGGTGGTTCCAGCTTCTCT 20 60.25 55 Intron1 401 Reverse GGTTTGGCATGCTTCTCTTC 20 59.82 50 Intrón 1 10 Forward AGGGTGGTTCCAGCTTCTCT 20 60.25 55 Intrón 1 398 Reverse TTGGCATGCTTCTCTTCAAA 20 59.54 40 Intrón 1 11 Forward AGGGTGGTTCCAGCTTCTCT 20 60.25 55 Intrón 1 397 Reverse TGGCATGCTTCTCTTCAAAA 20 59.54 40 Intrón 1 12 Forward CAGCGGCAGAATCAAACATA 20 59.83 45 Intrón 1 395 Reverse AGGAAATGGCCATCAAAGTG 20 59.93 45 Intrón 1 13 Forward AGCCAAGGTGTCACCAGAGT 20 59.76 55 Intrón 1 415 Reverse AGGAAATGGCCATCAAAGTG 20 59.93 45 Intrón 1 14 Forward GTGCCTTTAGCCAAGGTGTC 20 59.74 55 Intron1 423 Reverse AGGAAATGGCCATCAAAGTG 20 59.93 45 Intrón 1 15 Forward AATGCCTAGGAGTGCGATTG 20 60.24 50 Intrón 1 382 Reverse GGGGATATAACGCACAGCAT 20 59.81 50 Intrón 1 16 Forward CCAAGGTGTCACCAGAGTCA 20 59.70 55 Intrón 1 413 Reverse AGGAAATGGCCATCAAAGTG 20 59.93 45 Intrón 1 17 Forward AATGCCTAGGAGTGCGATTG 20 60.24 50 Intrón 1 321 Reverse TGCTAAAAGGGTGGATCTCG 20 60.21 50 Intrón 1 18 Forward ATGCCTAGGAGTGCGATTGT 20 59.72 50 Intrón 1 381 Reverse GGGGATATAACGCACAGCAT 20 59.81 50 Intrón 1 19 Forward TTTCCAGTTTGGGGCAATTA 20 60.29 40 Intrón 1 471 Reverse GGGGATATAACGCACAGCAT 20 59.81 50 Intrón 1 20 Forward GAGGTGTAGCTGTGGGCAGT 20 60.33 60 Intrón 1 490 Reverse AGGAAATGGCCATCAAAGTG 20 59.93 45 Intrón 1 Cuadro 5. Primers para Calmegin-CG1 seleccionados con sus propiedades fisicoquímicas. Características/No CG1F CG1R mbre Secuencia 5’- 5’- AGCACAGGATCTGGAGA TTCTAACAGCGGTGAAG TGG– 3´ CTG– 3´ Longitud 20 pb 20pb % GC 55 % 50 % Tm°C 60.22 59.22 Tamaño de 397 amplicón %GC: Relación contenido guanina – citosina. Tm°C: Temperatura de fusión. Fuente: Modificado de Orozco-Ugarriza et al., 2016. Cuadro 6. Primers para Calmegin-CG2 seleccionados con sus propiedades fisicoquímicas. Características/No CG2F CG2R mbre Secuencia 5’- 5’- AATGCCTAGGAGTGCG TGCTAAAAGGGTGGATC ATTG – 3´ TCG– 3´ Longitud 20 pb 20pb % GC 50 % 50 % Tm°C 60.24 60.21 Tamaño de 321 amplicón %GC: Relación contenido guanina – citosina. Tm°C: Temperatura de fusión. Fuente: Modificado de Orozco-Ugarriza et al., 2016. Cuadro 7. Resultado de subproductos de PCR in silico formados por los pares de primers Calmegin-CG1 y Calmegin-CG2 obtenidos del programa OligoAnalyzer Tool. Secuencias Horquillas N° de N° de Homodímeros Heterodímeros Calmegin- Forward 1(-0.83/35.3°C) 10 12 CG1 2(-0.65/32.4°C) 3(-0.58/33.2°C) Reverse 1(-3.12/52°C) 9 Calmegin- Forward 1(0.55/15.7°C) 9 14 CG2 2(0.98/5.9°C) 3(1.13/3.8°C) 4(1.45/-2.2°C) Reverse 1(0.84/9.1°C) 7 2(1.01/6.4°C) 3(1.16/3.1°C) 4(1.51/-5.9°C) 5(1.54/-8.1°C) 6(1.62/-4.2°C) Figura 1. Alineamiento de la secuencia nucleotídica de ADN y ARNm de la variante x2 del gen Calmegin, obtenidas del GenBank con el primer forward Calmegin – CG1. Figura 2. Alineamiento de la secuencia nucleotídica de ADN y ARNm de la variante x2 del gen Calmegin, obtenidas del GenBank con el primer reverse Calmegin – CG1. Figura 3. Alineamiento de la secuencia nucleotídica de ADN y ARNm de la variante x2 del gen Calmegin, obtenidas del GenBank con el primer forward Calmegin – CG2. Figura 4. Alineamiento de la secuencia nucleotídica de ADN y ARNm de la variante x2 del gen Calmegin, obtenidas del GenBank con el primer reverse Calmegin – CG2. Figura 5. Amplificación del gen Calmegin-CG1. Tamaño de amplicón: 397 pb. Gel de agarosa al 1.2%. Carril M: Marcador de peso molecular de 1 kb; Carril 1-7: Amplicones de muestras de alpaca y Carril 8: Control Negativo. Figura 6. Amplificación del gen Calmegin-CG2. Tamaño de amplicón: 321 pb. Gel de agarosa al 1.2%. Carril M: Marcador de peso molecular de 1 kb; Carril 1-7: Amplicones de muestras de alpaca y Carril 8: Control Negativo. DISCUSIÓN Este estudio es de importancia debido a que es necesario conocer información relacionada a la genética de la alpaca, y por ello se necesita estudiar el gen Calmegin. Vásquez et al (2011), realizó un primer estudio sobre el gen Calmegin en alpacas detectando transcriptos, lo cuales el transcripto que encontró era una cadena de ARNm de un tamaño de 97 pb, donde en el estudio que él publica no se describe que primers se utilizaron, ni la metodología mediante la cual se elaboraron estos primers, lo cual dista de lo trabajado en el presente estudio, en el cual se identificaron primero en forma in silico y luego mediante PCR convencional y electroforesis fragmentos de ADN. En la base de datos del NCBI se identificó que la secuencia del ADN del gen Calmegin descrita en alpacas presenta aproximadamente 41496 pb y 16 exones. En el presente trabajo, se empleó segmentos de la secuencia nucleotídica del gen Calmegin ubicada entre los pares de bases 395295 y 436791. Se realizó el alineamiento entre la secuencia de ADN y ARNm, con el fin de determinar la ubicación de los pares de primers seleccionados dentro del genoma de esta especie y así asegurarnos evitar las zonas donde se desconoce el orden de los nucleótidos. Por ello, permite tener mayor confiabilidad a comparación de otras investigaciones, donde realizaron alineamientos de secuencias entre especies filogenéticamente relacionadas para buscar zonas conservadas de interés ya que no contaban con suficiente información sobre la especie a investigar en la base de datos del NCBI (Tataje, 2013). A pesar de que la secuencia del cromosoma 2 han sido actualizadas, se ha comprobado in silico que aún hay alineamiento entre la secuencia de ADN nueva, la variante x2 del ARNm y los primers seleccionados. Para el diseño de primers de esta investigación se utilizaron programas bioinformáticos, en el cual, se diseñaron primers que respetan los principios propuestos por Rodríguez et al (2015), donde permiten predecir el Tamaño de primer, Temperatura melting (Tm), porcentaje de GC, estabilidad del extremo 3, entre otras características. Es por ello, que el empleo de diseño de primers in sílico en laboratorios clínico o de investigación, a partir de microorganismos eucariotas o procariotas, permite generar un punto de partida para futuras investigaciones, al igual, generando la disminución de los costos. A diferencia del presente trabajo, Thornton y Basu (2011) realizó el diseño y análisis de primers a partir de una secuencia de ARNm, en contraste, nosotros hemos utilizado la secuencia completa del gen Calmegin en alpaca. Para el diseño de primers se utilizó el programa bioinformático Primer3 que, en comparación de otras, ha sido empleada en diversas investigaciones por ser una herramienta valiosa, versátil y fácil de usar (Leandro-Cantor et al., 2016; De la Fuente et al., 2018) Se empleó PCR convencional para la validación de los primers por ser la técnica más usada en biología molecular, ya que permite obtener in vitro millones de copias de un fragmento de ADN a partir de una sola molécula (Tamay de Dios et al., 2013). Varios trabajos han obtenido a partir de esta técnica resultados de la amplificación deseada a partir del tamaño de los productos obtenidos in silico. (Pavia et al., 2003; Padilla et al., 2003; Serrato, et al., 2014; More, et al., 2011; Zueter et al., 2018). Existen investigaciones como la de Tataje (2013), donde busca genes homólogos a la Ciclina A1 (CCNA1) de especies emparentadas con la alpaca utilizando la técnica de PCR convencional para amplificar amplicones obtenidos del gen, en este caso, utilizaron un alineamiento de secuencias de animales filogenéticamente relacionados. En comparación con esta investigación, se utilizaron las secuencias específicas de alpaca, teniendo de esta manera resultados más confiables, este método sería ideal para el diseño de primers específicos, hay que recalcar que no en todos los casos es posible encontrar las secuencias necesarias para el objeto de estudio. Al igual Flores (2016) emplea la técnica de PCR para validar primers para el gen de proteína asociada a la queratina (KRTAP11-1) en alpacas, donde se consideraron válidos los primers cuyos amplicones obtenidos por PCR convencional y visualizados en gel agarosa coinciden con el tamaño de pares de bases esperado con lo diseñado in silico. Empleando la misma forma de validación, en este trabajo se validaron al comparar el tamaño de los amplicones obtenidos con los resultados del programa primer3, siendo para Calmegin- CG1 y Calmegin-CG2 cuyos tamaños serian 397 pb y 321 pb respectivamente (Figura 5-6). Basados en estudios previos donde se ha demostrado la importancia de Calmegin en otras especies como candidato para el mejoramiento genético de importancia reproductiva (Inoue, et al., 2011; Mishra, et al., 2013; Lin, et al., 2015; Okabe, 2015; Ikawa et al., 2011), la presente investigación es el primer reporte de diseño y validación de primers específicos para la identificación del gen Calmegin en tejido testicular de alpacas. CONCLUSIONES Es posible realizar el diseño in sílico de primers para el gen Calmegin en alpacas y la validación de estos mediante la técnica de PCR convencional. Los primers diseñados podrán servir en un futuro como base para estudiar con mayor profundidad el gen Calmegin. AGRADECIMIENTOS Esta investigación se realizó gracias al proyecto “Caracterización de marcadores moleculares en genes relacionados a espermatogénesis y fertilidad espermática a partir de transcriptomas de testículo y epidídimo de alpaca” (código: E041-2016-01), contrato 118- 2016 financiado por el Fondo Nacional de Desarrollo Científico, Tecnológico y de Innovación Tecnológica (FONDECYT). BIBLIOGRAFÍA 1. Abd-Elsalam K. 2003. Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design. African Journal of Biotechnology 2: 91-95. 2. Banda J, Evangelista S, Ruiz L, Sandoval R, Rodríguez C, Valdivia M et al. 2010. Efecto de dilutores en base a Tris, TES y leche descremada en la criopreservación de espermatozoides obtenidos del epidídimo de alpaca. Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú 21: 145-153. doi: 10.15381/rivep. v21i2.129 3. Barrantes C, Flores E, Ruiz J. 2018. Caracterización de planteles de los sistemas de producción alpaquera de la sierra central del Perú. 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