FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y BIOLÓGICAS CARRERA PROFESIONAL DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA “DISEÑO Y VALIDACIÓN DE PRIMERS PARA EL GEN PRM3 EN ALPACAS” Tesis para optar el título profesional de: MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA Presentado por: BRUNA MEDRANDA ROCHA (0000-0002-5712-3736) Asesor: SHIRLEY SUJEY EVANGELISTA VARGAS: (0000-0001-6105- 1889) Lima – Perú 2021 AGRADECIMIENTOS Esta investigación se realizó gracias al proyecto “Caracterización de marcadores moleculares en genes relacionados a espermatogénesis y fertilidad espermática a partir de transcriptomas de testículo y epidídimo de alpaca” (código: E041-2016-01), contrato 118-2016 financiado por el Fondo Nacional de Desarrollo Científico, Tecnológico y de Innovación Tecnológica (FONDECYT). Agradezco también a mi familia, por todo el apoyo a lo largo de mi carrera. A Shirley y Alejandra, por toda la ayuda y orientación para el desarrollo de este trabajo y a todos los tesistas del proyecto, con quienes trabajamos en conjunto. A todos los técnicos de laboratorio y personas que de alguna manera contribuyeron a la realización de esta tesis. RESUMEN Hasta la fecha no se ha anotado al gen PRM3 en el genoma de la alpaca, a pesar de su potencial relación con la motilidad espermática y su potencial utilidad para la selección y reproducción. El objetivo del presente estudio fue diseñar primers para amplificar por PCR convencional el gen PRM3 en alpacas. Los primers fueron diseñados empleando el programa Primer-BLAST y seleccionados con el programa OligoAnalyzer. De los 10 pares de primers diseñados, seleccionamos a los dos mejores de acuerdo al tamaño del amplicón (240 y 328pb) y sus propiedades termodinámicas (espontaneidad de hairpin y dímeros). Con el fin de validar los primers diseñados se realizaron pruebas de PCR convencional usando ADN genómico extraído a partir de tejido testicular. Los productos de PCR fueron corridos mediante electroforesis horizontal en gel agarosa al 2% y visualizados con SafeView Classic (abm®). Las bandas a tamaño esperado permitieron comprobar que el diseño de primers fue exitoso. Se concluyó que fue posible diseñar primers in silico para el gen PRM3 en alpaca y validarlos experimentalmente mediante PCR convencional. Palabras clave: Diseño de primers, ADN, PRM3, alpacas, PCR ABSTRACT To date, the PRM3 gene has not been annotated in the alpaca genome, despite its potential relationship with sperm motility and its potential utility for selection and reproduction. The objective of the present study was to design primers to amplify the PRM3 gene in alpacas by conventional PCR. Primers were designed using the Primer- BLAST program and selected with the OligoAnalyzer program. From the 10 pairs of primers designed, we selected the best two according to the size of the amplicon (240 and 328bp) and their thermodynamic properties (spontaneity of hairpin and dimers). In order to validate the designed primers, conventional PCR tests were performed using genomic DNA extracted from testicular tissue. The PCR products were run by horizontal 2% agarose gel electrophoresis and visualized with SafeView Classic (abm®). The bands at the expected size allowed us to verify that the primer design was successful. It was concluded that it was possible to design in silico primers for the PRM3 gene in alpaca and to validate them experimentally using conventional PCR. Key words: Primer design, DNA, PRM3, alpacas, PCR INTRODUCCIÓN En el Perú se encuentra la mayor población de alpacas (Vicugna pacos) a nivel mundial (MINAGRI, 2017). Este camélido sudamericano se destina principalmente a la producción de fibra, siendo de gran importancia para la industria textil y para las comunidades altoandinas (Fernández-Baca, 2005). El escenario ideal en producción animal es generar del mayor número posible de individuos superiores desde el punto de vista productivo y reproductivo. La calidad seminal es esencial para este fin, pero este carácter es multifactorial pues en él participan factores nutricionales, ambientales, fisiológicos y genéticos (Aoki et al., 2006). En alpacas, la continua selección de los parentales con la mejor fibra puede conllevar a la disminución de la calidad seminal (Cervantes et al., 2010b; Cruz et al., 2015; Cruz et al., 2017a; Cruz et al., 2017b; Gutiérrez et al., 2009; Gutiérrez et al., 2011; Gutiérrez et al., 2014; Paredes et al., 2014; Pérez-Cabal et al., 2010) afectando la producción a largo plazo. Una solución a este problema es la selección de parentales basado en marcadores moleculares. Se han descubierto marcadores moleculares asociados a caracteres reproductivos en varias especies (Barazani et al., 2014; Du Plessis et al., 2011; Harayama et al., 2017; Jodar et al., 2017; Kashou et al., 2013). Por ejemplo, en toros y ratones, los genes que codifican las llamadas protaminas son marcadores para calidad seminal (Grzmil et al., 2008; Kumar et al., 2014). Una ventaja de aplicar esta tecnología es la facilidad de selección en edades tempranas (Hood et al., 2004), pero para poder aplicarlo en alpacas es necesario encontrar los marcadores moleculares asociados a este carácter en esta especie. Las mencionadas protaminas, que son las codificadas por tres genes nucleares (PRM1, PRM2 y TNP2), se encargan del correcto empaquetamiento del ADN nuclear espermático, lo cual está estrechamente ligado a la calidad seminal (Cho et al., 2001; Hamilton et al., 2019; Jodar et al., 2017; Oliva, 2006; Torregrosa et al., 2006). Sin embargo, hay una cuarta protamina inicialmente encontrada en ratones, codificada por el gen nuclear PRM3, cuya presencia y rol han sido estudiados en varios mamíferos (Grzmil et al., 2008), más no en alpacas. Este gen sin intrones parece tener una estrecha relación con la motilidad espermática (Coello et al., 2010; Grzmil et al., 2008; Jodar & Oliva, 2014). Por ejemplo, se demostró que los ratones a los que se les eliminó el gen PRM3 mantuvieron su fertilidad, pero disminuyeron su motilidad espermática (Grzmil et al., 2008), mientras que en toros se concluyó de forma similar que la fertilidad no era afectada, pero que también juega un rol en la motilidad espermática (Kumar et al., 2014). Si bien en estas especies la tasa de fertilidad no es afectada, no es posible afirmar lo mismo en alpacas. Es conocida la complejidad de la reproducción en alpacas debido a su baja tasa de fertilidad (San Martin et al., 1968; Sumar & Adams, 1997), por lo que es necesario asegurar la producción seleccionando machos con espermatozoides de alta motilidad. Por este motivo, identificar la presencia y expresión del gen PRM3 en alpacas es esencial tanto para mejorar la comprensión de la fertilidad de esta especie como para optimizar los procesos de selección de reproductores. Para obtener marcadores moleculares asociados a este gen, se necesita la secuencia del mismo (e.g. bases de datos) y con ello es posible el diseño in silico de primers. El presente estudio tiene como objetivo el diseñar y validar primers para el gen PRM-3 en alpacas. MATERIALES Y MÉTODOS Debido que no se ha anotado la secuencia del gen PRM3 en alpacas, se utilizó el ARNm “predicted” de dicho gen (Código de acceso: XM_006204352.3), obtenido de la base de datos de la NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Esta es una secuencia obtenida in silico, en base a la información del genoma y a especies filogenéticamente relacionadas a la especie estudiada, más no ha sido secuenciada experimentalmente. Esta secuencia de ARN mensajero vendría a ser idéntica a la secuencia de ADN puesto que al ser un gen carente de intrones no hay proceso de splicing (Belluscio, 2013). Esta secuencia fue comparada con el genoma completo de la alpaca utilizando el programa bioinformático Nucleotide Blast, usando la base de datos RefSeq Genome Database (refseq Genomes), organism Vicugna pacos (taxid:30538) y optimizado para la búsqueda secuencias altamente similares (“megablast”). Luego se diseñaron primers in silico usando el programa Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) especificando como PCR template a la secuencia del ARNm del gen PRM-3 (XM_006204352.3), en la opción database a la secuencia completa del cromosoma 18 de la alpaca (NW_021964194.1) y en organism a Vicugna pacos (taxid:30538). Para evaluar estos primers y seleccionar los más adecuados se utilizaron los criterios de inclusión establecidos por Abd-Elsalam (2003) (Cuadro 1). Cuadro 1: Cuadro de criterios de diseño de oligonucleótidos – primers Criterio de diseño Características Tamaño 20-25 nucleótidos de longitud Base en el extremo 3’ Guanina (G) o Citosina (C) Temperatura melting (Tm) 50-65 ºC Contenido %GC 40-60% Auto-complementariedad Evitarla para minimizar formación de estructuras secundarias y dímeros Similaridad 100% de apareamiento con el molde Fuente: Modificado de Abd-Elsalam, 2003. Adicionalmente al uso de estos criterios de inclusión, se necesitó evaluar la espontaneidad de la formación de estructuras secundarias (horquillas y dímeros). Para ello se utilizaron los siguientes valores límites de energía libre de Gibss (∆G): • Para horquillas, un ΔG mínimo de -3 KCal/mol. Se seleccionaron valores mayores a este valor o positivos. Primers con valores más negativos fueron descartados. • Para homodímeros y heterodímeros, un ΔG mínimo de -6 KCal/mol. Se seleccionaron valores mayores a este valor o positivos. Primers con valores más negativos fueron descartados. Este paso se realizó in silico mediante el programa OligoAnalyzer Tool Primer Analysis de Integrated DNA Technologies (https://www.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer). Por ser parte del proyecto “Caracterización de marcadores moleculares en genes relacionados a espermatogénesis y fertilidad espermática a partir de transcriptomas de testículo y epidídimo de alpaca”, se trabajó con testículos de alpacas beneficiadas en el camal municipal de Huancavelica, que luego servirían para medir los niveles de expresión genética de los genes involucrados. Las alpacas machos seleccionados estuvieron en un rango de edad de 1 a 4 años, y que tuvieran ambos testículos, sin patologías visibles y un diámetro testicular mayor a 3 cm. En total, para todo el proyecto, se tomaron 51 muestras, haciendo referencia a un estudio similar realizado en humanos (Steger et al, 2003). Las muestras obtenidas fueron lavadas con suero fisiológico al 0.9% (luego de retirarse la túnica vaginal) y luego se colocaron por pares en bolsas con suero, que fueron conservadas a 5°C para poder ser transportadas a Lima (Banda et al., 2010). Una vez en Lima, las muestras fueron almacenadas en nitrógeno líquido a -196ºC. Para la extracción de ADN se utilizó el kit InnuPREP DNA Mini Kit (número de catálogo: 845-KS-1040250), siguiendo las instrucciones del fabricante (Analytik Jena AG, 2017). Se utilizaron las muestras que estuvieron almacenadas bajo criopreservación. La muestra tuvo que pasar por baño maría a 45° C para el descongelamiento, luego se colocó en una placa Petri y se hicieron diversos trozos de 1cm3 con hoja de bisturí, de un peso máximo de 50mg. Este kit permitió la obtención de ADN mediante la lisis de la membrana nuclear y la realización de dos lavados con el fin de disminuir agentes contaminantes. Finalmente, en la elución se disminuyó a la mitad el volumen obtenido con el fin de concentrar el ADN. Este procesamiento molecular se realizó en el Laboratorio de Biotecnología Reproductiva y Celular de la Universidad Científica del Sur. Para la cuantificación y medición de la pureza del ADN extraído, se utilizó un espectrofotómetro “Genova Nano micro-volume spectrophotometer”, el cual mide la absorbancia del compuesto presente, a una longitud de onda determinada. En el caso de la pureza, un ratio de A260/A280 de 1.8 a 2 indica una pureza alta de ADN libre de proteínas contaminantes, mientras que valores menores que 1.8 indicarían la presencia de proteínas. Por otro lado, valores menores a 1.5 en el ratio A260/A230 indica la presencia de contaminantes como carbohidratos, fenoles o sales siendo el rango óptimo es de 2.0 a 2.2. Las muestras de ADN que fueron amplificadas fueron aquellas que cumplieron con los criterios óptimos de pureza de ADN. El ADN extraído se mezcló con el reactivo innuMIX Standard PCR MasterMix (Analytik Jena AG) para preparar la mezcla de PCR convencional. Adicionalmente a esto, se corrieron controles negativos (agua, sin ADN) para corroborar que no ha habido contaminación. La receta que se siguió fue: • 5 µL de innuMIX Standard PCR Master Mix • 3.5 µL de H2O • 0.5 µL de cada primer (forward y reverse) los cuales tienen una concentración stock de 10 µM (Concentración final: 0.5 µM) • 1 µL de ADN molde, de ADN’s concentrados a 2 ng/µL, 5 ng/µL, 10 ng/µL y 15ng/µL La reacción fue llevada a cabo utilizando un termociclador Thermal Cycler (TC 9639, Benchmark) aplicando el siguiente perfil térmico: • 1 ciclo de desnaturalización inicial de 95ºC por dos minutos • 40 ciclos de 95ºC por 40 segundos (desnaturalización), 58ºC por 40 segundos (anillamiento), 72ºC por 40 segundos (elongación) • 1 ciclo de elongación final 72ºC de 10 minutos Por último, se evaluó la presencia y tamaño de los productos de PCR utilizando un gel de agarosa al 2%, una cámara horizontal (10cm x 10cm Labnet EnduroTM) y buffer de corrida TAE 1X (Cleaver Scientific®). Se corrió los amplicones durante 40 minutos a 90 voltios y para la visualización de los fragmentos amplificados se utilizó el colorante comercial de ácidos SafeView Classic (abm®) y se utilizó el marcador de peso molecular comercial de 1500pb (Ladder Express de Analytik Jena). Finalmente, se observaron los fragmentos amplificados en un fotodocumentador (EnduroTM GDS). RESULTADOS En la base de datos del NCBI se identificó la secuencia del ARNm predicted del gen PRM3 en alpacas (XM_006204352.3) a partir de su Portal Gene (Gene ID: 102543875). De acuerdo con los criterios de selección mencionados en el Cuadro 1, se programó el diseño para 10 pares de primers usando el programa Primer-BLAST del NCBI. Los valores de espontaneidades de horquillas y estructuras secundarias evaluados usando el programa OligoAnalyzer se muestran en el cuadro 2. De todos ellos se escogieron los dos mejores pares de primers, a los cuales se les denominó PRM3-P31-F, PRM3-P31-R, PRM3-P32-F y PRM3-P32-R. El primer PRM3-P31-F está ubicado entre los nucleótidos 9457507 y 9457488; el primer PRM3-P31-R entre 9457180 y 9457199, del cromosoma 18 (GCF_000164845.1). De la misma forma, el primer PRM3-P32-F está entre los 9457395 y 9457376 y el primer PRM3-P32-R está entre los 9457156 y 9457175 (Figura 1, 2, 3). Por otro lado, en la Figura 4, podemos observar los amplicones obtenidos para el par de primers PRM3-P31. Y en la Figura 5 vemos los amplicones correspondientes al par de primers PRM3-P32. En ambos casos se amplificó un producto comprendido entre los 250 y 350 pares de bases, lo que significa que el tamaño de los amplicones coincide con el tamaño de producto obtenido del programa Primer-BLAST: 240 pares de bases para PRM3-P31 y 328 pares de bases para PRM3-P32. En cuanto a los geles, el orden de los carriles fue el mismo para los dos primers: • Carril M: Marcador de peso molecular (1500pb) • Carril 1, 2: Non-template Control (NTC) • Carril 3: 10 ng de ADN • Carril 4: 5 ng de ADN • Carril 5: 2 ng de ADN • Carril 6: 15 ng de ADN Cuadro 2. Características de los 10 primers diseñados mediante el programa Primer- BLAST y evaluados en el programa OligoAnalyzer para el gen PRM3 en el genoma de la alpaca. ΔG ΔG Tamaño Tm (KCal/ (KCal/ Long ΔG # Primer Secuencia 5' - 3' amplicón GC% Tm (oC) mol) mol) (bases) (KCal (pb) (oC) Hair Homo Hetero/mol) pin dímer dímer o o Forward CTGCGTGAGTCAGGACAACT 20 55 63,7 -0,92 36,9 -1.34 1 240 -1.6 Reverse CTCTTTGAAACAGCGGCAGG 20 55 63,3 1,6 -0,5 -1.57 Forward GTCCAGAGAGGCAGCCAAAG 20 60 64,3 -0,58 37 -1.57 2 120 -1.57 Reverse AGTTGTCCTGACTCACGCAG 20 55 63,7 -0,68 33,5 -1.34 Forward TGCGTGAGTCAGGACAACTT 20 50 63,6 -0,92 36,9 -1.34 3 192 -1.34 Reverse TCAAGAGTGTGTCTGCTCGG 20 55 63,4 -0,75 39,2 -1.57 Forward CAAAGCAGGTGATGGGTTCC 20 55 63 -0,36 30,4 -1.47 4 86 -1.34 Reverse GGCCACAAGCTTCTTCATGG 20 55 63,3 -1,28 44 -1.95 Forward CCAAAGCAGGTGATGGGTTC 20 55 63 -0,62 33 -1.47 5 278 -1.57 Reverse CAAGAGTGTGTCTGCTCGGG 20 60 64,1 -0,75 39,2 -1.6 Forward CCTTTCCTCCCAGTCCAGAG 20 60 63,1 -0,08 26 -1.57 6 328 -1.57 Reverse TCTTCCTGGGCCATCGTCAT 20 55 65,2 0,98 4,3 -1.47 Forward CCGAGCAGACACACTCTTGA 20 55 63,4 -0,71 32,8 -1.57 7 70 -1.57 Reverse CTTCTCTTTGAAACAGCGGCA 21 47,6 63,1 -0,41 30,2 -1.57 Forward CCTGCGTGAGTCAGGACAAC 20 60 64,4 -2,95 47,3 -1.34 8 195 -1.34 Reverse ATCAAGAGTGTGTCTGCTCGG 21 52,4 63,7 -0,75 39,2 -1.47 Forward CAGTGGCCTTTCCTCCCAG 19 63,2 64,1 -0,85 37,3 -1.6 9 108 -1.6 Reverse TCTTCATGGAGGATTCGTGGC 21 52,4 63,9 -0,15 26,9 -1.47 Forward GTGGCCTTTCCTCCCAGTC 19 63,2 64 -0,85 37,3 1 -1.6 138 0 -1.34 Reverse GAAGTTGTCCTGACTCACGC 20 55 62,4 -0,68 33,5 -1.34 *Espontaneidad expresada como energía libre de Gibbs (∆G°) en Kcal/mol Cuadro 3. Características de los primers diseñados mediante el programa Primer-BLAST y evaluados en el programa OligoAnalyzer para el gen PRM3 en el genoma de la alpaca. Seleccionados en base a sus características termodinámicas. ΔG ΔG Tamaño Tm (KCal/ (KCal/ Long ΔG # Primer Secuencia 5' - 3' amplicó GC% Tm (oC) mol) mol) (bases) (KCal n (pb) (oC) Hair Homo Hetero/mol) pin dímer dímer o o Forward CTGCGTGAGTCAGGACAACT 20 55 63,7 -0,92 36,9 -1.34 P31 240 -1.6 Reverse CTCTTTGAAACAGCGGCAGG 20 55 63,3 1,6 -0,5 -1.57 Forward CCTTTCCTCCCAGTCCAGAG 20 60 63,1 -0,08 26 -1.57 P32 328 -1.57 Reverse TCTTCCTGGGCCATCGTCAT 20 55 65,2 0,98 4,3 -1.47 *Espontaneidad expresada como energía libre de Gibbs (∆G°) en Kcal/mol Figura 1. Vista gráfica de los pares de primers diseñados mediante el programa Primer- BLAST, de los que se seleccionó los pares 1 y 6. Figura 2. Alineamiento de la secuencia nucleotídica de ADN del genoma de la alpaca y el primer par de primers PRM3-P31 (forward y reverse) obtenida con el programa Primer-BLAST. Figura 3. Alineamiento de la secuencia nucleotídica de ADN del genoma de la alpaca y el segundo par de primers PRM3-P32 (forward y reverse) obtenida con el programa Primer-BLAST. Figura 4. Primer PRM3-P31. Gel de agarosa al 2%. Carril M: Marcador de peso molecular de 1500pb; Carril 1 y 2: NTC. Carril 3: 10 ng/µL de ADN. Carril 4: 5 ng/µL de ADN. Carril 5: 2 ng/µL de ADN. Carril 6: 15 ng/µL de ADN. Tamaño de amplicón: 240 pb. Figura 5. Primer PRM3-P32. Gel de agarosa al 2%. Carril M: Marcador de peso molecular de 1500pb; Carril 1 y 2: NTC. Carril 3: 10 ng/µL de ADN. Carril 4: 5 ng/µL de ADN. Carril 5: 2 ng/µL de ADN. Carril 6: 15 ng/µL de ADN. Tamaño de amplicón: 328 pb. DISCUSIÓN El gen PRM3 codifica para la proteína Protamina 3. Si bien hay pocos estudios acerca de esta proteína, hay evidencia de que cumple un rol relacionado con la motilidad espermática. Grzmil et al. (2008), realizaron un estudio donde se demostró que dicho gen se encuentra en varias especies de mamíferos. El gen PRM3 ha sido secuenciado en el dromedario Camelus dromedarius (Gene ID: 105089044), que es una especie relacionada con las alpacas. Gracias a esto, partimos de la premisa de que el gen se encuentra en el cromosoma 18 (Elbers et al., 2019). En este estudio, al utilizar el Primer- BLAST, los pares de primers seleccionados se unieron con una secuencia dentro del cromosoma 18. Esto, adicionalmente al hecho de que se diseñaron los primers en base al ARNm predicted del gen PRM3 de alpacas, nos llevan a comprobar que los primers sí amplifican el gen esperado en esta especie. Cabe resaltar, que el primer gel (Figura 4), muestra unas bandas inespecíficas que, si bien desaparecen utilizando 2 ng de ADN en la reacción, podrían indicar que los primers del par P31 se están adhiriendo a otra porción del genoma, aunque con menor intensidad. Esto nos indicaría que este primer par de primers no es específico. Esto no sucede en el segundo gel (Figura 5), por lo que el par P32 sería la mejor opción para futuros estudios. Existen otras investigaciones donde se realizaron alineamientos de secuencias entre especies filogenéticamente relacionadas para buscar zonas conservadas de interés por no contar con suficiente información acerca de la especie a investigar en la base de datos del NCBI (Tataje, 2013). El presente estudio, representaría una mejor opción en cuanto a metodología para obtener primers in silico. Muy pocos estudios describen el proceso de creación de primers, es por ello que en este trabajo se buscó validar el protocolo de diseño de primers in silico, con el fin de que este pueda ser utilizado en otras investigaciones como punto de partida. Para el diseño de primers en esta investigación se utilizaron programas bioinformáticos que permitieron que los primers creados respeten los principios propuestos por Rodriguez et al (2015), donde se permite predecir in silico diferentes características como el tamaño del primer, la temperatura melting (Tm), porcentaje de Guanina-Citosina (GC), estabilidad del extremo 3’, tamaño del amplicón, entre otras. Se utilizó principalmente el programa Primer-BLAST, que permite la alineación de las secuencias para su validación. Adicional a ello, se empleó la PCR convencional para la validación de los primers por ser la técnica más importante y revolucionaria en biología molecular, debido a que permite obtener in vitro millones de copias de un fragmento de ADN a partir de una sola molécula (Tamay de Dios et al., 2013). También, al igual que en un estudio realizado por Flores (2016), se consideraron válidos los primers cuyos amplicones obtenidos a través de la PCR convencional y corridos en gel de agarosa tenían un tamaño igual a los pares de bases esperados en el diseño in silico. Este estudio puede, por tanto, ayudar a tener un protocolo completo y fácil para obtener primers confiables y específicos in silico, especialmente en especies en las que el gen de interés no ha sido secuenciado. Es importante mencionar que se utilizó distintas cantidades de ADN target (en ng) para saber con qué cantidad se obtenía un mejor resultado. Se utilizaron cuatro diferentes cantidades en ng, obteniéndose el resultado esperado con cada una de ellas. Esto ayudó a demostrar que se puede usar menor cantidad de ADN (que en este caso fue de 2ng por reacción) sin que se vea afectado el resultado y obteniendo una banda definida en el gel (Figuras 4 - 5). Finalmente, cabe resaltar que el tiempo que se utilizó para correr el gel en electroforesis fue de 20 minutos, es por ello que se observa una gran separación entre el pocillo y el inicio del Ladder (marcador molecular). Así mismo, se podría utilizar un gel al 3% para mejorar la separación de las bandas del Ladder. Si bien esto no afecta el resultado final, si se puede mejorar dicha parte del protocolo con el fin de obtener una mejor separación de las bandas en el gel. CONCLUSIONES En conclusión, gracias a este estudio, se puede decir que es posible diseñar primers in silico para identificar el gen PRM3 en alpacas, así como validarlos experimentalmente mediante la técnica de PCR convencional y electroforesis en gel. Los primers diseñados pueden servir como base para realizar más estudios acerca de este gen. Por último, la presente investigación es el primer reporte de diseño y validación de primers para la identificación del gen PRM3 de alpacas. LITERATURA CITADA 1. Abd-Elsalam, K. (2003). Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design. African Journal of Biotechnology. 2(5): 91-95. 2. Aoki, V. Liu, L. Carrell, D. (2006). A novel mechanism of protamine expression deregulation highlighted by abnormal protamine transcript retention in infertile human males with sperm protamine deficiency. Molecular Human Reproduction. 12: 41–50. 3. Banda, J. Evangelista, S. Ruiz, L. et al. (2010). 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