FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y BIOLÓGICAS CARRERA PROFESIONAL DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA “IMPORTANCIA DE LA ENZIMA “L-asparaginasa” EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Y EN SALUD PÚBLICA” Trabajo de Investigación para optar el grado académico de: Bachiller en Medicina Veterinaria y Zootecnia Presentado por: Yadira Cinthya Urquizo Acevedo (0000-0001-8430-9408) Asesor: Luis Fernando Cerro Temoche (0000-0003-3207-1041) Lima – Perú 2021 1 2 Agradecimientos En primer lugar, agradecer a mi abuela Octavia, que, aunque no esté conmigo físicamente para cuidarme, pero siempre siento su protección. A mis padres y hermanos que siempre me apoyaron en todas las metas que tengo. A Eduardo Taz y Joaquín Vásquez por siempre creer en mí, y no dejar que nunca me dé por vencida A mi asesor Luis Cerro por siempre estar dispuesto desde el inicio a ser mi guía para este trabajo. 3 Índice Pag. Lista de abreviaturas .................................................................................................................. 2 Resumen ..................................................................................................................................... 4 Abstract ...................................................................................................................................... 5 I. Introducción ............................................................................................................ 7 II. Revisión de literatura .............................................................................................. 8 2.1 Antecedentes históricos ................................................................................................. 8 2.2 Fuentes y características fisicoquímicas de la enzima L-Asparaginasa ........................ 8 2.3 Farmacodinamia y farmacocinética ............................................................................ 10 2.4 Salud pública .............................................................................................................. 11 2.4.1 Uso contra líneas celulares cancerígenas ..................................................... 11 2.4.2 Efectos adversos del uso de L-asparaginasa ................................................ 13 2.5 Industria alimentaria .................................................................................................. 16 2.5.1 Clasificación de la acrilamida ..................................................................... 16 2.5.2 Afecciones por el consumo de acrilamida y dosis permitida ....................... 18 2.5.3 Mitigación de la acrilamida ......................................................................... 19 III. Conclusiones ......................................................................................................... 20 IV. Referencias bibliográficas .................................................................................... 21 4 Lista de abreviaturas L-Aase L-asparaginasa E.coli Escherichia coli LLA Leucemia linfoblástica aguda LMA Leucemia mieloblástica aguda SER Sistema reticuloendotelial PAE Pseudomona aeruginosa P. cyclopium Penicillium cyclopium IARC Agencia Internacional de Investigación del Cáncer SNFA Dirección Nacional de Alimentación de Suecia ACGIH American Conference of Govermental Industrial Hygienists FDA Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos C° Centígrados Da Dalton IgE Inmunoglobulina E IgG Inmunoglobulina G US EPA Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos EU Unión Europea 5 Resumen La L-asparaginasa (L-Aase), es la primera enzima estudiada con características antineoplásicas. Propiedades que ha tomado mucha relevancia dentro de dos industrias: alimentaria y de salud pública. En el presente trabajo se abarcará información que data del año 1904, año donde se descubrió la actividad citotóxica que contiene esta enzima, para luego realizar diversos experimentos verificando cómo responde frente ciertas líneas celulares cancerígenas, además, se ha venido buscando las características óptimas de la enzima, viendo los factores que afectan su estabilidad. Asimismo, a lo largo de los años se ha venido encontrando múltiples fuentes para obtener la L-asparaginasa, teniendo hoy en día varias opciones para poder disponer de ella, como fuentes animales y vegetales. Sin embargo, los procesos cinéticos que se producen en el organismo por el uso de esta enzima aún no están totalmente descritos, del mismo modo tampoco se conoce con exactitud lo que todos los procesos que la enzima genera en el organismo. Dentro de la salud pública, se viene investigando el efecto citotóxico de la L-Aase frente a diversas líneas celulares y también, se viene estudiando el mejor protocolo usando la enzima para el tratamiento frente a diferentes afecciones oncológicas. Puesto que, se ha visto múltiples reacciones adversas en pacientes con un tratamiento prolongado, por lo que se sugiere realizar más estudios. En la industria alimentaria, se ha visto la presencia de un compuesto orgánico llamado acrilamida, sustancia que ha sido clasificada como “posiblemente cancerígena”, formándose en un grupo de alimentos expuestos a ciertas condiciones. Llamando la atención de la comunidad científica, puesto que genera diversas lesiones en el organismo por su consumo excesivo. Es por ello, que se está en realizando muchos estudios para ver la mejor manera de mitigar los niveles de este compuesto usando la enzima L-Aase. 6 Abstract L-Asparaginase is the first enzyme studied that possesses antineoplastic properties. These properties have become very meaningful in two industries: the food industry and the public health industry. This study will include information dating back to 1904, years during which many experiments were conducted that tested the cytotoxic activity this enzyme possesses against different cell lines. Furthermore, there are multiple studies which will look at the enzyme’s optimal characteristics and factors that affect its stability. In addition to this, researchers have continued to find new sources from which to extract the L-asparaginase enzyme, such as animal and vegetable sources. However, the pharmacokinetics and pharmacodynamics of this enzyme are still unknown. The public health industry has been investigating the cytotoxic properties against cancer cell lines along with the best treatment protocol using this enzyme against said cancer cells. Similarly, the food industry has become one of the largest industries in the world and recently an organic compound called acrylamide has been found in many foods. Classified as a probable carcinogen in humans, this compound has attracted the attention of the scientific community and consequently many studies are being carried out to find the best way to mitigate the levels of this carcinogen using the L-Aase enzyme. 7 I. Introducción L-asparaginasa (L-Aase) es una enzima de la clase hidrolasa, que a lo largo de los años se ha destacado por sus características citotóxicas contra células cancerígenas. Uno de los primeros aportes se dio por Kidd en 1953, quien inoculo el suero sanguíneo del cuy, el cual posee la enzima, verificando la regresión de linfomas en ratas. En secuencia de este estudio, en los 60´s, Broome evidenció el efecto de la L-Aase que de la misma manera era la responsable de la regresión de tumores en su diseño experimental (Broome, 1961; Broome, 1963). A causa de estos resultados actualmente la L-Aase tiene mucha relevancia en tratamientos oncológicos de personas (Orabi et al., 2019). La L-Aase se puede obtener de múltiples fuentes, como de especies bacterianas, siendo las más comunes Escherichia coli y Erwinia chrysanthemi; géneros fúngicos como Penicillium y Aspergillus (Cachumba et al., 2016); especies vegetales como Vigna unguiculata (Moharib, 2018) y Lupinus luteus (Orabi et al., 2019); y especies animales, siendo la especie más destacada Cavia porcellus, en donde encontramos la enzima en el suero hemático (componente liquido de la sangre tras permitir la coagulación). Uno de los campos donde tiene mayor relevancia, es en la industria farmacéutica, donde existen tres presentaciones, dos de ellas derivadas de Escherichia coli (E.coli), y la otra derivada de Erwinia chrysanthemi (Nunes et al., 2020). En esta industria, se toma como una alternativa de tratamiento en diferentes tipos de afecciones oncológicas como la leucemia linfoblástica aguda (LLA) (Ronghe et al., 2001), leucemia mieloide aguda (LMA) (Kaspers, 2019) y linfoma no hodgkin (Muss et al., 1990). Asimismo, la utilidad de la L-Aase dentro de la industria alimentaria ha comenzado a tomar importancia, porque reduce la formación de la acrilamida, compuesto que se forma al exponer ciertos alimentos a temperaturas mayores a 100° C 8 (Becalski et al., 2003). Siendo actualmente, la acrilamida clasificada por la Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer (IARC) como “probable carcinógeno para los humanos” (clase 2A) (IARC, 1994). En este contexto, se propuso describir la importancia de la enzima L-Aase dentro de estas dos industrias para mostrar data experimental relevante de modo resumido, para traer consigo mayor interés sobre esta enzima, y se pueda obtener mejores resultados en protocolos oncológicos y una mejor mitigación de sustancias toxicas como la acrilamida. II. Revisión de literatura 2.1 Antecedente histórico La actividad hidrolítica de la enzima L-asparaginasa (L-Aase), fue observada primero por Lang (1904), luego confirmada por Fürth y Friedmann (1910), quienes además verificaron esta actividad en órganos de caballos y de cerdos, asimismo, Clementi (1922) demostró que, en diversas especies animales la enzima L-Aase está presente solo en el hígado, pero los herbívoros tienen la presencia de la L-Aase en la mayoría de los tejidos órganos. Luego, Clementi también descubrió esta actividad hidrolítica de la L-Aase en la sangre de cuy (Cavia porcellus). Años más tarde, Kidd (1953) le atribuye a la L-Aase propiedades antitumorales por la regresión de linfomas que observó en un experimento (Michalska & Jaskolski, 2006). 2.2 Fuentes y características fisicoquímicas de la enzima L-Asparaginasa La L-Aase se puede obtener de múltiples fuentes; como bacterias, animales, levaduras y vegetales. Entre las bacterias que producen la enzima L-Aase encontramos a: Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas aeruginosa, Helicabacter pylori, Mycobacterium tuberculosis, Yersinia pseudotuberculosis YpA (Orabi et al., 2019), siendo las más relevantes: Escherichia coli y Erwinia chrysanthemy, (Huang et al., 2006, citado en Orabi et al., 2019). 9 Sin embargo, cabe resaltar que no todos los organismos mencionados producen la misma cantidad de L-Aase y los requerimientos para la obtención es distinta. Asimismo, Moharib (2018) ha demostrado que a partir de las semillas de ciertas legumbres como la Vigna unguiculata se puede purificar la enzima L-Aase, realizando en primer lugar una precipitación con sulfato de amonio, luego purificándola mediante cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de filtración de gel. En este estudio, muestra que las condiciones que brindaban la mejor estabilidad fueron en un pH alcalino de 8.5 y una temperatura de 37°C por 30 minutos, cabe resaltar que el rango de temperatura y pH en donde la enzima se mantenía estable era amplia. Por otro lado, en este mismo estudio se vio su actividad anticancerígena contra cuatro diferentes líneas de carcinoma in vitro, viendo que tiene un alto efecto de inhibición contra las líneas carcinogénicas: HEPG2 (hígado) y HCT-116 (colon). Existen fuentes fúngicas para la obtención de L-Aase, como son los géneros Fusarium, Aspergillus y Penicillium, con relación a esto, Luhana et al. (2013) purificaron la enzima L- Aase a partir del hongo Aspegillus niger usando cromatografía de intercambio aniónico. En el estudio se evidencia que la enzima tiene una actividad máxima en un pH 6, pero su actividad se mantuvo desde un pH 3 a pH 10. La temperatura optima que mostró el estudio fue de 37°C. Asimismo, tiene mayor Vmax (velocidad máxima de la reacción enzimática), que otros reportes de otras enzimas L-Aase aisladas de otras fuentes fúngicas. Además, el Km (constante de Michaelis-Menten), la cual es una constante que está directamente relacionada con la afinidad del sustrato, es menor en comparación a otros estudios, eso quiere decir que hay una mayor afinidad con el sustrato. Todos estos datos, sugieren que la enzima L-Aase purificada del hongo Aspergillus niger, puede ser una promesa para la industria. 10 Otros organismos de los cuales se puede aislar la enzima L-Aase es a partir de Actinomicetos, como las especies de Streptomyces, que tienen amplia distribución en hábitats marinos y terrestres. Existen muchas especies de este género, una de ella es Streptomyces fradiae NEAE-82, la cual se puede obtener mediante purificación del Actinomiceto y utilizando el método de cromatografía de intercambio iónico. El- Naggar et al., (2016) demostraron que la L-Aase purificada de Streptomyces fradiae NEAE-82 puede ser una opción de agente anticancerígeno por su alta actividad catalítica, y estabilidad ante varios rangos de pH (4.5 - 10.5) y temperatura (25 - 60°C). Además, en su estudio mostraron, la actividad citotóxica de esta enzima frente a líneas celulares como Caco2 (células de adenocarcinoma colorrectal epitelial humano), HepG2 (células de carcinoma hepatocelular) y Hep2 (células de carcinoma laringe humano), siendo mayor contra Caco2, viendo un 80.91% de citotoxicidad, comparado con un 39.95% de citotoxicidad contra Hep2 y 36.798% contra HepG2 respectivamente. 2.3 Farmacodinamia y farmacocinética La farmacodinamia se basa en la hidrolización de aminoácido no esencial, asparagina, en ácido aspártico y amonio, agotando las reservas de asparagina del suero, generando que las células dependientes entren en apoptosis. Además, se sabe que las células cancerígenas tienen mucho más requerimiento de asparagina, ya que son incapaces de generar su propio suministro, puesto que carecen de asparagina sintetasa, por lo tanto, estas células dependerán de una administración extracelular. En consecuencia, la deficiencia de asparagina alterará la síntesis de proteínas y conducirá a una inhibición retardada en la síntesis de ADN y ARN, llevando esto a una mala función celular, y trayendo como consecuencia la muerte de las células blásticas (Müller & Boos, 1998). La administración de la L-Aase puede ser de manera intramuscular o endovenosa, a pesar de tener la misma efectividad, se han observado mayores reacciones de hipersensibilidad 11 por la vía endovenosa. La vida media mostrada en el plasma va a depender del microorganismo del cual se ha aislado, por ejemplo, la L-Aasa aislada de E.coli toma mucho más tiempo de desaparecer en el plasma, tomándose hasta 31 horas, mientras que la L-Aase aislada de E.crysanthemi tiene una vida media de 16 horas (Asselin et al., 1993, citado en Gentili et al., 1996). Por otra parte, Broome (1968) encontró una actividad pobre en el bazo después de 24 horas de administración de L-Aase, pero una alta actividad en el hígado, sugiriendo que la eliminación de esta enzima es por el sistema reticuloendotelial (SRE), siendo Hall en 1970, quien concluyó con sus estudios que la eliminación primaria de la L-Aase es ciertamente por el sistema SRE (Society, n.d.). SRE, es actualmente conocido como sistema fagocítico mononuclear, compuesto por macrófagos, células dendríticas y monocitos. Este sistema tiene como una de sus funciones principales a la linfocitopoyesis y a la función fagocitaria (Villar, 2019; Cavelier, 1936). 2.4 Salud pública La Organización Mundial de la Salud (OMS) tiene como propuesta incluir a la asparaginasa PEG-E.coli dentro de sus medicamentos esenciales para el tratamiento de la LLA, y junto la agencia de Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA), están de acuerdo que la L-Aase es uno de los medicamentos más efectivos para el linfosarcoma y para la leucemia linfoblástica aguda (LLA) (Orabi et al., 2019). La demanda mundial muestra que la relevancia de le enzima, estimando 420 millones de dólares en inversión para compra de esta enzima para el 2025 (Alam et al., 2019). 2.4.1 Uso contra líneas celulares cancerígenas La aplicación de la L-Aase viene desde el año 1970 como parte del protocolo quimioterapéutico de la LLA (Piatkowska-Jakubas et al., 2008). Siendo la L-Aase aislada de la 12 bacteria E.coli, la más usada en estos tratamientos (Ronghe et al., 2001, p. 7). Borah et al., (2012) purificaron la enzima a partir de E.coli, precipitándola con sulfato de amonio y luego usando cromatografía de intercambio iónico. Mostrando en su estudio que la temperatura y pH óptima para la L-Aase proveniente de E.coli son 55°C – 6 respectivamente. Tallal et al., (1970) usaron a la L-Aase como agente único mostrando una remisión completa hasta en el 60% de los casos. En adición, también se ha visto remociones completas cuando se combina la L-Aase con otros fármacos para la misma afección. Como el estudio de Lobel et al., (1979), quienes vieron una remisión completa en pacientes con LLA expuestos a terapia con metotrexato y L-asparaginasa aislada de E.coli. Cabe resaltar que la dosis y la periodicidad de la administración de la L-Aase para la remisión de las células cancerígenas aún son discutidas. Asimismo, se ha evaluado esta actividad anticancerígena frente a otras líneas celulares. Fatima, Khan y Khan (2019) evaluaron una actividad anticancerígena de L-Aase proveniente de Pseudomona aeruginosa (PAE) contra la línea celular HeLa (línea celular de cáncer de cuello uterino), demostrando que la L-Aase aislada de PAE inhibe el crecimiento de células cancerígenas del cuello uterino en humanos in vitro. De igual manera, Mostafa et al., (2019) estudiaron la L-Aase proveniente de Bacillus velezensis, aislada del mar rojo, evidenciando que el pH más favorable es de 6.5 y la temperatura de 37°C. Además, en este estudio se vio efecto anticancerígeno contra la línea celular MDA-MB-231 (linea celular de células cancerígenas mamarias), pero se necesita realizar más investigaciones para su uso en tratamientos oncológicos. Igualmente, esta enzima también es una promesa estratégica en casos de leucemia mieloide crónica, ya que genera un aumento en la inhibición y apoptosis en las células K562 y KU812 (líneas celulares derivadas de leucemia mieloide) (Trang et al., 2016). De igual manera, 13 hoy en día la L-Aase forma parte de varios protocolos oncológicos como: enfermedad Hodking, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, melanosarcoma, reticulosarcoma, leucemia linfoblástica crónica, leucemia mieloblástica, linfoma no hodgkin’s (El-Naggar et al., 2014). Convirtiéndose de esta manera en una enzima relevante para tratamientos cancerologicos, teniendo varios nombres comerciales como A-ase, ASN.ase, Elspar, Crasnitin, PEG-asaparaginasa, Colapase, Crisantas, Pasum (El-Naggar et al., 2014). 2.4.2 Efectos adversos del uso de L-asparaginasa Uno de los efectos adversos más recurrentes por el uso prolongado de la L-Aase es la hipersensibilidad. Esta reacción puede causar la inactivación de la asparaginasa por la producción de anticuerpos, generando en muchos casos una reacción llamada “hipersensibilidad silenciosa” o “inactivación silenciosa” (Hanif, 2017). Aun no es claro cómo se da la hipersensibilidad, pero se relaciona a la inmunoglobulina G (Ig G) y a la inmunoglobulina E (Ig E) con este efecto adverso (Rathod et al., 2019). En caso se desarrolle esta hipersensibilidad durante el tratamiento, la enzima L-Aase se neutraliza (Cecconello et al., 2020) Un estudio relevante ha asociado varias de las reacciones adversas con la actividad glutamina que también puede poseer la enzima, ya que la L-Aase desamina la asparagina en ácido aspártico y amonio, y también puede desaminar la glutamina en acido glutámico y amonio (Chan et al., 2014), generando esta última desaminación una disrupción de síntesis proteica, pudiendo estar relacionada con efectores colaterales (Nguyen et al., 2016). En relación con ello, se ha venido realizados estudios que han verificado que la enzima L-Aase con alta especificidad por la asparagina y baja afinidad por glutamina, obtuvieron resultados de menos reacciones adversas. Sin embargo, las drogas comerciales tienen presente la actividad glutamina, 14 hidrolizando la L-glutamina hasta un 9% de la actividad total de la hidrolisis (Brumano et al., 2019). Debido a estos cuadros de hipersensibilidad, se ha buscado opciones de L-Aase que carezcan de la actividad L-glutamina, siendo la más conocida, la L-Aase proveniente del suero del cuy (Cavia porcellus) la cual carece de esta actividad, viendo esto como una ventaja (Schalk et al., 2014). Pero, se debe de tener en cuenta también que la actividad la L-glutamina tiene características anticancerígenas, cuya primera observación fue en 1964 por Greeberg et al., (como se citó en Orabi et al., 2019). Luego, EL-Asmar y Greenberg (1966) observaron un retardo en el crecimiento de 6C3HED (linear celular de linfoma) y L1210 (células de leucemia), asociándolo con la reducción de glutamina generado por la actividad L-glutamina. Por otro lado, otra afección muy frecuentemente reportada es la pancreatitis en humanos. Esta reacción adversa tiene una alta incidencia de presentación (10–16%) en los pacientes tratados con esta enzima, pero aún se desconoce el mecanismo por la que se puede generar este efecto colateral. Kearney et al., (2009) mencionan que la relación del uso enzima L-Aase y la presentación de pancreatitis, puede deberse a una predispoción del paciente por factores genéticos y no a un efecto acumulativo por terapias de largo periodo con la enzima. Ya que también, se sospecha que al ser el páncreas un órgano de alta síntesis proteica, la falta de asparagina puede generar un daño colateral, puesto que este aminoácido no esencial es necesario para la síntesis de algunas proteínas pancreáticas. Con relación a esto, se sugiere realizar un seguimiento tanto de los signos clínicos y biomarcadores pancreáticos del paciente durante el tratamiento con esta enzima (Cohen & Valverde, 2018). También, se ha reportado efectos adversos a nivel del hígado, como disfunción hepática, pudiendo verse una elevación de los niveles de bilirrubina y transaminasa, niveles anormales de fosfatasa alcalina, una disminución de albumina sérica y los niveles de fibrinógenos y 15 también las lipoproteínas séricas pueden estar elevadas en los pacientes humanos expuestos a un tratamiento que incluye la enzima L-Aase (Arora et al., 2019). De igual manera se ha visto casos de diabetes, por una disminución en la insulina, por un daño asociado a los islotes pancreáticos (Palma et al., 2013). Asimismo, también se ha reportado otros eventos tales como, formación de trombos, nausea, diarrea, vomito, dolor de cabeza, dolor abdominal, disfunciones del sistema nervioso central, mucositis, urticaria (en el punto de inyección) y broncoespasmo (Brumano et al., 2019). Pero, para que se desarrolle cualquiera de estos efectos secundarios se debe de tener en cuenta los diferentes factores de riesgo, por ejemplo, en el caso de pancreatitis secundaria a quimioterapia con L-Aase, los factores de riesgos conocidos son la exposición a un régimen de quimioterapia de alto riesgo y también factores genéticos (Cohen & Valverde, 2018). Por otro lado, se ha observado menos reacciones adversas usando PEG-L-asparaginasa. La PEG-L-asparaginasa es un conjugado de monometoxipolietilenglicol y L-Aase derivada de Escherichia coli (nativa), siendo 6 a 9 veces más potente que la L-Aase aislada de E.coli sin conjugaciones. Esta es una droga sintética de eliminación rápida, inmunogenicidad reducida y una vida media mayor. Estas características la hacen formar parte de la primera linea en protocolos oncológicos modernos contra LLA, ya que al tener una acción más prolongada se evita suministrar de manera seguida, haciendo que el paciente pueda tolerar mucho más el tratamiento (Kurtzberg et al., 2011). En adición, la L-Aase aislada de Erwinia chrysathemi, está asociada a menos reacciones alérgicas incluso en comparación con la PEG-L-asparaginasa. Esto se relaciona por tener una vida media menor que la proveniente de E.coli, de tan solo de 0.65 días en comparación de 1.24 días respectivamente, y también por tener diferentes estructuras antigénicas (Ko et al., 2015). Por ello, es usada como segunda linea para tratamientos oncológicos, en casos donde se 16 observan reacciones alérgicas en pacientes tratados con la L-Aase proveniente de E.coli sin conjugación (Guilleme et al., 2013). 2.5 Uso en la industria alimentaria La relevancia de esta enzima no solo es dentro de la industria químico-farmacéutica y clínica humana, sino también dentro de la industria alimentaria, por su capacidad de hidrolizar. Por lo que se usa para disminuir la formación de una sustancia denominada por la Agencia Internacional de Investigación del Cáncer (IARC), como agente posiblemente carcinogénico- llamada “acrilamida”. Sustancia que se ha visto presente en muchos alimentos como el café, trigo, centeno, pan, papas, al someterlos a ciertas condiciones de temperatura y pH (Ortiz & Baqué, 2004; Calderón, 2015; Pedreschi et al., 2010). La acrilamida es un compuesto orgánico (C3H5NO) de bajo peso molecular, su peso molar es 71.08 Da, de color cristalino, sin olor, altamente hidrosoluble, también es soluble en glicerol, etilenglicol, ácido láctico, pero insoluble en etanol, metanol y éter (WHO, 2011). Tiene otros nombres como: etileno-carboxamina, prop-2-enamida o 2-propenamide (IUPAC). Este compuesto, tiene varios usos como la producción de floculantes, para la purificación del agua potable (WHO, 1996), también está dentro de la industria cosmética, funcionando como un aglutinante y fijador de cabello (Anderson, 2005) . Sin embargo, la Universidad de Estocolmo junto a la Dirección Nacional de Alimentación de Suecia (SNFA), descubrieron su presencia, en altas concentraciones, en alimentos ricos en carbohidratos como las papas fritas, generando esto una alerta (Belcalski et al., 2003; Paul et al., 2016). 17 2.5.1 Clasificación y formación de la acrilamida La Agencia Internacional de Investigación sobre el cáncer (IARC), en 1994 clasificó la acrilamida como “probable carcinógeno para los humanos” (clase 2A), porque es biotransformada en el metabolito glicidamida, metabolito genotóxico (IARC, 1994). Además, es clasificada en la categoría A3 por la American Conference of Govermental Industrial Hygienists (ACGIH) como “carcinogénica en animales, desconocido en humanos” (ACGIH, 2011, como es citado en ATSDR, 2012). Asimismo, la Unión Europea (EU) ha incluido a la acrilamida en la categoría “2” de mutagénicos (FAO/OMS, 2002). Sin embargo, hasta ahora, ni la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) ni el Comité Mixto FAO/OMS, no concluyen en una cantidad diaria tolerable (TDI). La formación de la acrilamida en los alimentos aún no está totalmente descrita, pero Valenzuela y Ronco (2007) mencionan que para la formación de este monómero se requiere azúcares reductores y temperaturas mayores a 100°C. Además, se sabe que unas de las rutas que predominan para la formación de acrilamida puede ser a partir de la acroleína (IUPAC: 2- propenal), esta puede ser formada como resultado de diversos procesos oxidativos como la reacción de Maillard. La acroleína puede aportar su carbonilo funcional y este se juntaría con una asparagina libre, formando la acrilamida. Estas reacciones pueden suceder a partir de la degradación térmica de lípidos, la degradación de aminoácidos y proteínas, degradación de carbohidratos y en la reacción de Maillard. Por ende, cuando se agrega esta enzima, genera que se reduzca la cantidad de asparagina, reduciendo la posibilidad de que se forme la acrilamida (Valenzuela & Ronco, 2007) El mecanismo por el cual la reacción de Maillard genera acrilamida, aun no se conoce totalmente, se propone que el grupo α-amino reacciona con la fuente de carbonilo, formando una base “Schiff”, y al someterlo a calor, esta base se descarboxila. Este puede hidrolizarse para 18 formar 3-aminopropioamida que se puede degradar más, mediante la eliminación de amoniaco, formando de esta manera la acrilamida (Zyzak et al., 2003). Como menciona Feather (1994, como se citó en Zyzak et al, 2003) la reacción de Maillard se da entre azúcares reductores con un grupo amino libre, que proviene de un aminoácido o de una proteína, generado compuestos como monocarbonilo y dicarbonilo, siendo estos los responsables de la pigmentación pardusca y modificaciones de olor y sabor, que van a favorecer a las características organolépticas del producto. En pocas palabras, para la formación de acrilamida es necesario la presencia de azúcares libres y aminoácidos expuestos a temperaturas elevadas. En caso de la papa, muchos reportes mostraron que la formación de la acrilamida es proporcional a la reducción de las concentraciones de azúcares en la papa (Xu et al., 2016). En las papas fritas se ha encontrado 117 µ𝑔 kg−1 de acrilamida como mínimo y 4125 µ𝑔 kg−1 como máximo y chips de papas 59 µ𝑔 kg−1 como mínimo y 5200 µ𝑔 kg−1 como máximo (Paul et al., 2016). 2.5.2 Afecciones por el consumido de acrilamida y dosis permitida El consumo de alimentos con acrilamida de manera frecuente genera a la larga muchas consecuencias, sobre todo a nivel nervioso. La neuropatía generada por el exceso de acrilamida, dañan las fibras nerviosas, las cuales sufren una degeneración retrógrada lenta y progresiva como se vio en el estudio de Hopkins y Gilliaty (1971, se citó en Spencer & Schaumburg, 1975). Además, Tanni y Hashimoto (1990) vieron la inhibición del crecimiento de las neuritas del ganglio de la raíz dorsal en ratas expuesta a acrilamida. Asimismo, en un estudio de Pennisi et al., (2013) se desmostró, que después de un largo periodo exposición de trabajadores a la acrilamida, se puede llegar a acumular en el organismo, generando disfuncional cerebelar seguido por neuropatía, considerándose un riesgo ocupacional. 19 Godin et al., (2000) reportaron una respuesta anormal en la evaluación del reflejo pupilar, una degeneración progresiva reinal y cambios en los discos nerviosos ópticos, en una población de ganado después de una intoxicación accidental con acrilamida. Asimismo, se ha visto afección severa en axones del nervio tibial distal en ratas expuestas a 50 mg/ kg/ día durante 11 días (Lehning & Lopachin, 1994). Por otro lado, también puede generar daños a nivel reproductivo, puesto que se sabe que reduce los niveles de testosterona llevando esto a un reducción de la función testicular, generando esto una reducción del volumen seminal y esterilidad (Dearfield et al., 1988). La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA), señala que para que genere presencia de tumores se indica una ingesta de 0,17 mg/kg peso corporal/día, y para cambios neurológicos se indica 0,43 mg/kg peso corporal/día (Hurtado et al., 2017). Por otro lado, la OMS, realizó ciertos experimentos en ratas en 1985, valorando una ingesta diaria tolerable (IDT) de 12 ug/kg de peso corporal/día, para evitar daños a nivel nervioso. En el 2016, la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (US EPA) fija como valor límite máximo de acrilamida en agua como monómero en 1mg 𝐿−1 (US EPA, 2016). 2.5.3 Mitigación de la acrilamida Teniendo en cuenta estos puntos importantes, donde la formación de acrilamida se relaciona con la reacción de Maillard, se ha venido estudiando y probando distintas formas de como mitigar la formación de este agente y una de ellas es usando la L-Aase. Zyzak et al., (2003) realizaron un experimento con la L-Aase proveniente de la bacteria Erwinia chrysanthemi, observando como resultado una disminución de un 88% de asparagina, evitando de esta manera la formación de este componente probablemente cancerígeno en un 99%. Del mismo modo, se realizó un estudio similar con una L-Aase proveniente de la bacteria Escherichia coli, viendo una actividad hidrolítica del 75% de las asparaginas libres, 20 llevando esto a una reducción de acrilamida de 55% (Kimbonguila et al., 2019). De la misma forma, también se ha visto que las L-Aase purificada a partir de microorganismos pertenecientes al reino fungí, pueden ser usada para una reducción de acrilamida, como Penicillium cyclopium (P. cyclopium). Shafei et al., (2015) mostraron que la formación de acrilamida en papas frías tratadas con L-Aasa proveniente de P.cyclopium era menor en un 92% aproximadamente en comparación de la no tratadas. Asimismo, L-Aase purificada de Trichoderma viride, también se ha visto como un potencial para la mitigación de acrilamida (Lincoln & More , 2014). De igual manera se ha estudiado otras formas de aminorar la presencia de esta sustancia, como la adicción de glicerina, añadiéndola antes de exponerla al calor, generando competencia con la acrilamida, bajando de esta manera sus niveles. Por otro lado, también se ha visto la opción, de modificar el manejo, como el decrecimiento de la temperatura, que se utiliza ya sea para freír u hornear ciertos alimentos, la restricción del tiempo y disminución del pH (Xu et al., 2016). Comercialmente dentro de la industria alimentaria, la L-Aase se comercializa bajo los nombres Acrylaway y PreventASe. PreventASe, fue lanzada por la empresa DSM (DSM Food Specialities) en el 2007, aislando de L-Aase a partir de Aspergillus niger (Xu et al., 2016). En un estudio de Ciesarová (2014 como se cita en Xu et al., 2016) se usa como parte del tratamiento para la reducción de acrilamida, obteniendo como resultado una reducción del 46% de acrilamida en pan tostado, pero se menciona que llegar a niveles mayores de 95% dependiendo de la aplicación. Por otro lado, Acrylaway, es aislada a partir de Aspergillus oryzae, y llega generar una reducción de acrilamida de un 68 a 83% (Kimbonguila et al., 2019). III. Conclusiones - Se ha visto el poder citotóxico de la L-Asparaginasa (L-Aase) frente a múltiples líneas celulares patógenas. 21 - El uso dentro de tratamientos oncológico de la L-Asparaginasa (L-Aase) es principalmente en casos de leucemia linfoblástica aguda (LLA). - Se ha mejorado la expectativa de vida en pacientes con leucemia linfoblástica aguda (LLA), con el uso de L-Asparaginasa (L-Aase) como parte del tratamiento oncológico. - Los efectos adversos más comunes por el uso de L-Asparaginasa (L-Aase), son hipersensibilidad y pancreatitis, pero se propone realizar más estudios, puesto que existen múltiples fuentes de donde se puede extraer la L-Asparaginasa (L-Aase), y cada una tiene características diferentes, que pueden ayudar a distintos requerimientos. - La actividad L-glutamina, está muy relacionada con los efectos adversos que puede generar el tratamiento con L-Asparaginasa (L-Aase), sin embargo, se debe de tener en cuenta, que esta actividad también tiene características anticancerígenas, por ello, se debe de reevaluar el hecho de usar L-Asparaginasa (L-Aase) sin actividad L-glutamina. - Dentro de varias industrias esta la presencia de la acrilamida, sustancia presuntamente cancerígena, por la que se debe evaluar con mayor relevancia el hecho de poder disminuir estas cantidades presentes en alimentos y agua de bebida con ayuda de la enzima L- Asparaginasa (L-Aase), puesto que se ha demostrado la reducción de la acrilamida por el uso de esta enzima. 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