FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y BIOLÓGICAS CARRERA PROFESIONAL DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA “SEROPREVALENCIA DE ANTICUERPOS CONTRA Neospora caninum EN BOVINOS DE CRIANZA EXTENSIVA EN LOS DISTRITOS DE CHUMPI, CORACORA Y PULLO DE LA PROVINCIA DE PARINACOCHAS, AYACUCHO” Tesis para optar el título profesional de: Médico Veterinario y Zootecnista Presentado por: Angela Nelita Fernández Cevallos: 0000-0001-5344-0702 Asesor: Siever Miguel Morales-Cauti: 0000-0002-5396-8889 Lima – Perú 2020 Seroprevalencia de anticuerpos contra Neospora caninum en bovinos de crianza extensiva en los distritos de Chumpi, Coracora y Pullo de la provincia de Parinacochas, Ayacucho Angela Fernández Cevallos¹; Siever Morales-Cauti1,2 ¹ Carrera de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Científica del Sur, Lima, Perú ² E-mail: sieverm@hotmail.com RESUMEN El objetivo del presente estudio fue determinar la seroprevalencia de anticuerpos contra Neospora caninum en ganado bovino de crianza extensiva en los distritos de Chumpi, Coracora y Pullo de la provincia de Parinacochas, Ayacucho. Se trabajó con 209 muestras de suero sanguíneo de bovinos, mayores a 4 meses de edad, fueron analizados mediante la técnica ELISA indirecta con el uso del kit IDEXX Neospora 2X Ab para detectar anticuerpos contra Neospora caninum. Se encontró 12.21% ± 4.44% de seroprevalencia corregida de anticuerpos contra Neospora caninum; presentó una asociación estadística significativa (p<0.05) para la variable procedencia, siendo el distrito de Coracora el mayor valor de prevalencia con 19.71% ± 7.47%. Se confirma la evidencia de circulación antigénica de este parásito en los bovinos de crianza extensiva de la provincia de Parinacochas. Palabras clave: Neospora caninum, anticuerpos, bovino, seroprevalencia, aborto, serodiagnóstico (Fuente: MeSH) Abstract: The objective of the present study was to determine the seroprevalence of antibodies against Neospora caninum in extensive farming cattle in the districts of Chumpi, Coracora and Pullo of the province of Parinacochas, Ayacucho. It worked with 209 blood serum samples from bovines, older than 4 months of age, they were analyzed by indirect ELISA use of the IDEXX Neospora 2X Ab kit to detect antibodies against Neospora caninum. A corrected seroprevalence of antibodies against Neospora caninum was found to be 12.21% ± 4.44%; presented a significant statistical association (p<0.05) for the origin variable, obtaining the district of Coracora the highest prevalence value with 19.71% ± 7.47%. The evidence of antigenic circulation of this parasite in extensively reared cattle in the Parinacochas province was confirmed. Key words: Neospora caninum, antibodies, bovine, seroprevalence, abortion, serodiagnosis (Source: MeSH) INTRODUCCIÓN En el Perú, contamos con aproximadamente 5,2 millones de cabeza de ganado bovino, siendo la raza criolla la más predominante con el 63.9% en diferentes regiones del país, y el 36.1% restante está constituido por las diferentes razas de bovinos (INEI, 2012). La ganadería desarrollada en el país, es considerada una de las actividades económicas más importantes, debido a que se constituye como una fuente primordial de ingresos para las familias en gran parte del territorio nacional (MINAGRI, 2017). La población ganadera presenta una mayor distribución poblacional en la sierra, donde el ganado bovino es principalmente de doble propósito y el sistema de crianza es predominantemente extensiva (MINAGRI, 2017; Rosemberg, 2018), caracterizando a esta realidad un tipo de manejo de los animales a nivel sanitario, nutricional, genético, y de poblacional, que favorece el pleno desarrollo de enfermedades que perjudican su productividad, afectando la situación económica de los ganaderos (MINAGRI, 2017). Las enfermedades del ganado bovino pueden ser causadas por diversos agentes etiológicos, entre ellos, los parásitos como Neospora caninum que ocasionan principalmente abortos (Rivera, 2001). La Neosporosis bovina es una enfermedad infecciosa de etiología parasitaria, causada por el protozoario intracelular obligado Neospora caninum, perteneciente al phylum Apicomplexa (Khan et al., 2019), que genera una disfunción reproductiva en bovinos (Dubey et al., 2007). Está ampliamente distribuida en varios países considerándola una de las principales causas de aborto bovino (Khan et al., 2019; Pereyra et al., 2020). Ribeiro et al. (2019), analizaron 189 estudios con reportes de prevalencia en diferentes países, estimando una prevalencia combinada de 8% en Oceanía, 13% en África, 15% en Europa, 18% en Asia, 24% en América, corroborando su amplia distribución geográfica de la enfermedad; causando principalmente pérdidas productivas y reproductivas en el ganado, que repercuten a nivel económico y sanitario (Vega, 2010). Este parásito posee un ciclo de vida heteroxeno facultativo, tiene como hospederos definitivos a los perros y a los coyotes (McAllister et al., 1998; Gondim et al., 2004; Wilson et al., 2016) y como hospederos intermediarios a una amplia gama de animales, entre los que destacan los bovinos por su mayor susceptibilidad (Moore et al., 2005; Dubey et al., 2006; Ribeiro et al., 2019). La parasitosis se adquiere por la ingestión de ooquistes excretados por los canes y transmitidos horizontalmente por vía digestiva a los bovinos (transmisión horizontal) (Girata, 2016), o a través de la infección del parásito al feto vía transplacentaria (transmisión vertical); siendo ésta última vía considerada una de las principales fuentes de transmisión y persistencia de la infección en el bovino, ya que hembras infectadas perpetúan el parasitismo de generación en generación (Tuemmers, 2017; De Aquino et al., 2019). Esta enfermedad se caracteriza por ser típicamente asintomática, con excepción en los bovinos gestantes donde se presenta el aborto (Dubey, 2017), y cuya presentación se da a partir del segundo tercio de gestación por vía transplacentaria sin causar lesiones que inviabilicen al feto, naciendo infectado y asintomático (Serrano-Martínez et al., 2018; Martínez et al., 2012). Sin embargo, existe la posibilidad de otras complicaciones que dificulten la viabilidad del feto produciendo la muerte en el útero, nacimientos prematuros, neonatos débiles con problemas neuromusculares, momificación fetal, placentitis, disentería y fiebre aguda por dos o tres días (Dubey et al., 2007; Girata, 2016; Wilson et al., 2016). En el Perú, existen reportes sobre la presencia de Neospora caninum demostrando que está ampliamente distribuido a nivel nacional, presentando prevalencias desde 3% hasta casi el 60% según el estudio realizado por SENASA; donde se reporta una prevalencia específica para Ayacucho de 15.01% (SENASA, 2011). Así también, otros autores han reportado prevalencias entre 18.1% y 68.3% en diferentes regiones del país (Atoccsa et al., 2005; Vélez et al., 2013; Granados et al., 2014; Portocarrero et al., 2015; Arauco, 2018; Serrano-Martínez, 2018). Para el diagnóstico, existen diversos métodos por el cual se puede identificar la presencia o infección por N. caninum, siendo estas técnicas histopatológicas, moleculares y de aislamiento (Sánchez-Castilleja et al., 2018). Las pruebas inmunodiagnósticas disponibles son la inmunofluorescencia indirecta (IFI), ELISA, aglutinación directa, inmunohistoquímica (IHQ) y electroforesis combinada con inmunodetección (Western Immunblot) (Bermúdez, 2014). A nivel mundial, no existe ningún protocolo estandarizado para el diagnóstico de neosporosis bovina (Dubey et al., 2007; McAllister, 2016); Sin embargo, el método común de diagnóstico en los estudios seroepidemiológicos es mediante técnica de ELISA indirecta que permite la identificación de anticuerpos en el suero sanguíneo de los animales (Álvarez, 2003; Da Silva et al., 2019). Esta técnica es confiable debido a que posee una sensibilidad y especificidad mayor a las obtenidas con la IFI, además carece de subjetividad cuando se debe emitir el resultado, siendo otra ventaja la facilidad para procesar un gran número de muestras (Rodríguez, 2015; Serrano- Martínez et al., 2018). Por todo ello, el presente estudio busca estudiar la frecuencia de presentación de seroreactores a anticuerpos contra Neospora caninum en condiciones de crianza extensiva en tres distritos de la provincia de Parinacochas, ubicada al sur del país. MATERIALES Y MÉTODOS Lugar de estudio y animales El presente estudio se desarrolló en el mes de mayo del 2018, comprendiendo los distritos de Coracora, Chumpi y Pullo de la provincia de Parinacochas, ubicada al sur de Ayacucho (Perú), con una altitud que abarca desde los 2800 hasta 3500 m.s.n.m. La zona posee geográficamente planicies, colinas y laderas de montañas, con temperaturas que oscilan entre los 6.6ºC hasta los 25.5ºC (Aronés et al., 2003; SENHAMI, 2019). El procesamiento de las muestras se realizó en el laboratorio de microbiología de la Universidad Científica del Sur. El muestreo fue de tipo aleatorio, considerando animales mayores a 4 meses de edad sin distinción de sexo, raza, ni categoría zootécnica. La clasificación de la categoría zootécnica fue definida en base a la guía técnica elaborada por la UNALM (Almeyda y Parreño, 2011). Además, se entrevistó a los propietarios de cada fundo para identificar el estado reproductivo y edad de los bovinos muestreados. Tamaño muestral El tamaño mínimo de muestra se calculó mediante la fórmula para estimar poblaciones finitas (Wayne, 2012), considerando la población bovina de los distritos de Coracora (13,988 bovinos), Chumpi (5,339 bovinos) y de Pullo (7,736), dando un total de 27,063 bovinos (CENAGRO, 2012), utilizando una seroprevalencia referencial de 15,01% (SENASA, 2011), con un nivel de confianza de 95% y un error admisible de 5%; donde se obtuvo un tamaño mínimo de muestra de 197 animales; distribuidas proporcionalmente en Coracora (n1=102) Chumpi (n2=39) Pullo (n3=57). Se muestrearon 209 muestras de sueros bovinos en total. Colección de muestras Las muestras de sangre fueron colectadas con el uso del sistema al vacío por punción directa en la vena yugular mediante tubos al vacío sin anticoagulantes de 10 mL (tipo Vacouteiner). Posteriormente, los tubos fueron rotulados y transportados al laboratorio del hospital central de la ciudad de Coracora, dentro de las cuatro horas siguientes para ser centrifugados a 1600 G por 5 minutos, obteniendo el suero sanguíneo, para, finalmente, ser almacenados a –20 °C hasta su procesamiento. Técnicas de laboratorio Se uilizó la técnica de ELISA indirecta para confirmar la presencia de anticuerpos contra el parásito Neospora caninum mediante el Kit IDEXX Neospora x2b. Análisis de datos Los resultados de seroprevalencia de animales positivos a los anticuerpos contra Neospora caninum, se presentaron en porcentajes de frecuencia con intervalo de confianza al 95% (Wayne, 2012). Se realizó la presentación de los resultados mediante la caja de bigotes para evidenciar de mejor forma estos. Asimismo, se determinó la seroprevalencia corregida, considerando los índices de sensibilidad (98.5%) y especificidad (97.9%) de la prueba técnica de ELISA IDEXX Neospora X2 Ab, con sus respectivos intervalos de confianza al 95% (Thursfield, 1990; Álvarez-García et al, 2013). El análisis estadístico, se realizó mediante la prueba de chi-cuadrado para determinar si existía asociación entre la presencia de anticuerpos contra N. caninum y las variables de sexo, categoría zootécnica, raza, procedencia y estado reproductivo (Martínez, 2009). RESULTADOS Se detectaron anticuerpos contra N. caninum en 29 individuos de los 209 animales muestreados, obteniendo una seroprevalencia cruda de 13.9% con un IC 95%: 9.2 %– 18.3% con una prevalencia corregida de 12.21% con un IC 95%: 7.8 %– 16.6% (cuadro 1). En los distritos se observaron diferentes niveles de seroprevalencia, teniendo el porcentaje más bajo Chumpi con el 3.81%, y el valor más alto lo obtuvo Coracora con un 19.71%. Los resultados para la variable sexo, muestran que los machos presentan índices mayores de seroprevalencia de anticuerpos contra N. caninum 19.43% (5/24), en categorías zootécnicas, los terneros 18.57% (1/5), y la raza Brown Swiss 16.13% (12/68), en estado reproductivo las vacas preñadas 17.27% (3/16) (Cuadro 1). Determinándose la asociación estadística significativa únicamente para la variable procedencia (p<0.05) Cuadro 1: Seroprevalencia de Neospora caninum (n=209) en bovinos de crianza extensiva de los distritos de Chumpi, Coracora y Pullo, Ayacucho Intervalo de Intervalo de Prevalencia Prevalencia Variables Positivos Total confianza 95% confianza 95% cruda (%) real (%) Mínimo Máximo Mínimo Máximo Sexo Macho 5 24 20.8 4.6 37.1 19.4 3.6 35.26 Hembra 24 185 13.0 8.1 17.8 11.3 6.72 15.84 p=0.295 Categoría zootécnica Ternero 1 5 20.0 0.0 55.1 18.5 0.0 52.66 Vaquilla 1 17 5.9 0.0 17.1 3.9 0.0 13.15 Torete 3 16 18.8 0.0 37.9 17.3 0.0 35.79 Vaca 23 156 14.7 9.2 20.3 13.1 0.0 18.42 Toro 1 6 16.7 0.0 46.5 15.1 0.0 43.77 Vaquillona 0 9 0.0 0.0 5.0 0 0 0 p=0.704 Raza Criollo 17 120 14.2 7.9 20.4 12.5 6.6 18.44 Holstein 0 6 0.0 0.0 0.0 0 0 0 Brown 12 68 17.6 8.6 26.7 16.1 7.39 24.87 Swiss Simmental 0 8 0.0 0.0 5.0 0 0 0 Hereford 0 7 0.0 0.0 5.0 0 0 0 p=0.379 Procedencia Chumpi 2 40 5.0 0.0 11.8 3.0 0.0 8.31 Coracora 23 109 21.1 13.4 28.8 19.7 12.24 27.18 Pullo 4 60 6.7 0.4 13.0 4.7 0.0 10.12 p=0.007 Estado reproductivo Vacía 20 140 14.3 8.5 20.1 13.2 7.59 18.81 Preñada 3 16 18.8 0.0 37.9 17.3 0.0 35.79 p=0.633 Total 29 209 13.9 9.2 18.6 12.21 7.77 16.65 Figura 1. Diagrama de dispersión de la edad de bovinos evaluados según resultado a la prueba diagnóstica de N. caninum En la figura 1, se muestra un diagrama de cajas y bigotes de la dispersión de la edad en bovinos evaluados ante la prueba de diagnóstico de anticuerpos contra N. caninum. Se observa una mayor dispersión en la edad en los bovinos que resultaron negativos a la prueba. El rango del grupo negativo oscila desde los 4 meses a 12 años, con una mayor concentración de individuos entre las edades de 3 a 6 años y una mediana de 5 años. Por otro lado, las edades de bovinos positivos a la prueba, se encuentran en un rango que oscila desde los 5 meses hasta 8 años, siendo en su mayoría individuos de 3 a 5 años, y una mediana de 4 años. Figura 2. Diagrama de caja y bigotes de la frecuencia de bovinos positivos y negativos a la prueba diagnóstica de N. caninum En la figura 2, se exhiben los resultados del número de partos de todas hembras bovinas que fueron positivos o negativos a la prueba de diagnóstico de N. caninum. Observándose que el grupo de animales negativos presenta un rango entre 1 a 4 partos con valores atípicos de 5, 6 y 7 patos. Sin embargo, el grupo de animales positivos presenta un rango que oscila desde 1 a 5 partos, y concentrándose en su mayoría entre los valores de 1 a 3 partos, con una mediana de 3 partos. DISCUSIÓN La seroprevalencia cruda de 13.9% con un IC 95%: 9.2 %– 18.3% con una prevalencia corregida de 12.21% con un IC 95%: 7.8 %– 16.6% (Cuadro 1), resultado similar a otro estudio realizado por SENASA (2012) en la misma región de Ayacucho con una seroprevalencia reportada de 15.01%, pero inferior a otras reportadas en diversas regiones de Perú, como en Oxapampa con 18.8% (Portocarrero et al., 2015), en Lima con 46.6% (Serrano-Martínez et al., 2019), en Tacna con 28.7% (Vélez et al., 2013), y Junín con 15.3% (Arauco, 2018), confirmando así la prevalencia de esta enfermedad en la región de Ayacucho. Además, valores hallados recientemente, en otros países de América del Sur, también muestran prevalencias variadas de neosporosis bovina, donde Venezuela reporta un 21% (Pinilla y Da Silva, 2018), Chile un 21.1% (Tuemmers et al., 2017), Ecuador un 23.4% (Maldonado et al., 2020), Argentina un 35.3% (Pereyra et al., 2020), Paraguay un 41.4% (Gimenez et al., 2019), Colombia con 52% (Cruz-Estupiñan et al., 2019) y Brasil un 71.4% (de Aquino et al., 2019). Estas diferencias de prevalencias en los reportes mencionados anteriormente, posiblemente sea debido al sistema de producción, ya que estudios demuestran que la prevalencia es mayor en ganado lechero, sugiriendo una influencia por las diferencias genéticas respecto al ganado de carne, teniendo estos últimos más resistencia a la infección por N. caninum (Serrano-Martínez et al., 2018; Ribeiro et al., 2019); Además de las diferencias en el sistema de manejo, el presente estudio es de crianza extensiva comparado con los estudios mencionados en el párrafo anterior que se desarrollan en crianza intensiva y semi-extensiva, con mayor uso de tecnología; considerando la importancia del uso de registros, programas de sanidad y mejor implementación de la higiene de los hatos (Ribeiro et al., 2019), o mayor susceptibilidad de algunas razas (Dubey et al., 2007). Por otro lado, las diferencias geográficas, nivel de precipitación, temperatura ambiental y clima de los lugares de estudio, podrían influir en la viabilidad de los ooquistes, siendo este parásito encontrado incluso en otras latitudes, como lo reportado en Irán con prevalencias de 24.8% (Gharekhani y Mohammad, 2019) y en Kenia con un 24.1% (Olum et al., 2019). El lugar de procedencia fue la única variable que presentó asociación estadísticamente significativa (p<0.05) con la prevalencia de anticuerpos contra N. caninum, teniendo la localidad de Coracora la mayor seroprevalencia con un 19.71% + 7.47%; esto puede deberse a las diferencias en las condiciones de crianza en los distritos evaluados, mayor presencia de canes domésticos en las granjas de Coracora por la proximidad de los fundos a la ciudad, siendo esto considerado un factor de riesgo muy importante (Vanleeuwen et al., 2010; Ribeiro et al., 2019; Pereyra et al., 2020), posibilitando mayor contacto con material placentario eliminado, permitiendo la transmisión horizontal debido a la ingestión de ooquistes. Otra característica del distrito de Coracora es que presentan hatos con un mayor número de animales, favoreciendo potencialmente una mayor oportunidad de transmisión del patógeno, siendo corroborada esta característica en diferentes reportes donde mencionan que, en los predios con más de 100 bovinos, el riesgo de la infección es mayor (Portocarrero et al., 2015; Gharekhani et al., 2019). Los resultados obtenidos en cuanto al sexo del animal, no presentaron asociación estadística (p>0.05) con respecto a la enfermedad (Cuadro 1), coincidiendo con otros estudios que reportan que dicha variable no es un factor predisponente para la infección de N. caninum (Vega, 2010; Gharekhani et al., 2016; Gharekhani et al., 2019; Satragno et al., 2019). A pesar de no existir una diferencia entre ambos sexos, las diferencias hormonales podrían cumplir un roll importante en la susceptibilidad del huésped a la infección por N. caninum, ya que presentan variaciones hormonales durante el ciclo estral, y la depresión inmunológica de la madre durante el segundo trimestre de la gestación, pudiendo influir potencialmente a una mayor susceptibilidad (López et al., 2005; Dubey et al., 2007). Por otro lado, con respecto a la variable razas, esta no presentó asociación significativa (p>0.05) con respecto a la seropositividad frente a N. caninum; corroborado por el reporte de Munhoz et al. (2009); Siendo más bien relacionado al objetivo del sistema de producción bovino (Moore et al., 2005; Dubey et al., 2007), debido potencialmente al mayor tiempo de vida de los animales en el sistema de producción lechero, esto también es corroborado cuando se evalúa el sexo y el tipo de empadre utilizado en la granja (Serrano-Martinez et al., 2018; Gharekhani et al., 2019). No se estableció asociación estadística significativa (p>0.05) entre la edad y el diagnostico de anticuerpos contra N. caninum, siendo corroborado por diferentes reportes donde identifican que la infección es independiente a la edad (Segundo, et al., 2009; Vélez, et al., 2013; Cruz-Estupiñan et al., 2019, Ribeiro et al., 2019). Sin embargo, otras investigaciones reportan la edad como un factor de riesgo asociado a la neosporosis bovina, mencionando que donde a mayor edad existe un mayor riesgo de seropositividad, debido a la presencia de animales persistentemente infectados y a transmisión vertical, perpetuando la enfermedad (Atoccsa et al., 2005; Pullido et al., 2017; Banegas, 2018; Semango et al., 2019; Olmo et al., 2019). Además, Dijkstra et al. (2001) sugiere la importancia de incluir animales jóvenes a los estudios, ya que los terneros con infección congénita tienen altos niveles de anticuerpos. Se evaluó el estado reproductivo de 156 vacas, analizando el estado de preñes en comparación a la no preñes (vaca vacía) no presentando asociación estadística significativa (p>0.05), es decir, el parásito podría estar presente en cualquier etapa reproductiva. Sin embargo, Pullido et al. (2016) reportan la asociación de animales positivos con el historial de abortos y el número de partos, presentando una mayor proporción de positividad los animales con más de 3 partos; lo cual sugiere que las hembras son infectadas desde temprana edad (vía vertical) y lo títulos de anticuerpos se mantienen elevados por años. Además, podría depender de otros factores como la etapa de gestación, el grado de virulencia del parásito, y la exposición reciente al parásito evidenciándose en un aumento de anticuerpos (Dubey et al., 2017; Jiménez et al., 2017). El presente estudio reporta, por primera vez, la seroprevalencia de N. caninum en los distritos de Chumpi, Coracora y Pullo, pertenecientes a la provincia de Parinacochas. Ciertamente, existe un reporte en la Región de Ayacucho, pero no es específica de la zona en estudio (SENASA, 2011). Se escogieron los tres distritos con mayor número de ganado, este trabajo se realizó en condiciones de crianza extensiva, donde la falta de registros, plan sanitario e información de los sistemas de producción no permiten concluir de forma categórica con la identificación de factores de riesgos o características propias de la infección producido por el patógeno en estudio. Sin embargo, a pesar de las limitaciones, los resultados obtenidos son importantes para el entendimiento de la epidemiología y útil para poder implementar un plan de manejo, prevención y control de la enfermedad. Teniendo en cuenta que la neosporosis bovina es considerada como una de las principales causas de aborto bovino, es importante capacitar a los ganaderos y brindarles información sobre las enfermedades, el uso de registros, apuntar los eventos de abortos, repetición de celos, manejo de residuos (placentas), reposición de animales seropositivos a N. caninum, entre otros. Siempre de la mano con las buenas prácticas de bioseguridad. Cabe recalcar que los datos recolectados confirman la presencia del parásito, más no la enfermedad. Es necesaria más información para poder asociarla con episodios de abortos. CONCLUSIONES • La seroprevalencia corregida de anticuerpos contra Neospora caninum es de 12.21% ± 4.44%, confirmando su presencia en los distritos de Chumpi, Coracora y Pullo de la provincia de Parinacochas, Ayacucho en el 2018 • Existe asociación estadística significativa (p<0.05) entre los distritos de Chumpi, Coracora y Pullo, con la presencia de anticuerpos contra el parásito Neospora caninum. BIBLIOGRAFIA CITADA 1. Álvarez G. 2003. Identificación y caracterización de antígenos de “Neospora caninum” con interés inmunodiagnóstico en bovinos. Tesis de pregrado. Madrid: Univ. Complutense de Madrid. 302p. 2. Álvarez G, Collantes E, Costas E, Rebordosa X, Ortega L. 2003. 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