FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y BIOLÓGICAS CARRERA PROFESIONAL DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA “DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE Escherichia coli SEROTIPO O157:H7 Y RESISTENCIA ANTIMICROBIANA EN ALIMENTOS TIPO BARF PARA PERROS EN LIMA, PERÚ, 2019” Tesis para optar el título de: Médico Veterinario Zootecnista Presentado por: Kiara Carolina Ortega Vassallo: (https://orcid.org/0000-0002-2779- 6526) Asesor: Siever Morales Cauti: (https://orcid.org/0000-0002-5396-8889) Lima – Perú 2020 DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE Escherichia coli SEROTIPO O157:H7 Y RESISTENCIA ANTIMICROBIANA EN ALIMENTOS TIPO BARF PARA PERROS EN LIMA, PERÚ, 2019 DETERMINATION OF THE PRESENCE OF Escherichia coli SEROTYPE O157: H7 AND ANTIMICROBIAL RESISTANCE IN BARF FOR DOGS IN LIMA, PERÚ, 2019 Kiara Ortega Vassallo1, Siever Morales Cauti1 1Facultad de Ciencias Veterinarias y Biológicas, Universidad Científica del Sur, Perú. RESUMEN El objetivo del presente estudio fue determinar la presencia de Escherichia coli (E. coli) O157:H7 y resistencia antimicrobiana en alimentos tipo BARF (Alimentos crudos biológicamente apropiados) para perros, comercializados en distintos distritos de Lima, Perú. Se analizaron 124 muestras de dietas crudas congeladas pertenecientes a 15 marcas diferentes, cada muestra de distinto lote. Se realizó el aislamiento microbiológico estándar haciendo uso de medios de cultivo MacConkey y EMB, y su identificación por medio de pruebas bioquímicas; para la serotipificación de E. coli O157, se utilizó Látex test (Oxoid TSMX4147C) con partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos reactivos al antígeno somático O157, y para la identificación del antígeno H7, similar Látex test específico (RIM E. coli O157:H7 Latex Test - Oxoid TSMX9410). El presente estudio no logró identificar cepas E. coli O157:H7 dentro de las muestras analizadas; sin embargo, el 65.32% (81/124) con un IC95%: 56.9% – 73.7% de las muestras evaluadas fueron positivas a E. coli. Del total de colonias positivas a E. coli aisladas de alimento tipo BARF, el 38.18% fueron resistentes a los 12 antimicrobianos evaluados. No existe la presencia de E. coli serotipo O157:H7 en dietas BARFs para perros comercializadas en Lima. Palabras claves: Escherichia coli, O157: H7, carne, crudo, dieta, contaminación, perro, antimicrobiano, resistencia a fármacos ABSTRACT The objective of the present study was to determine the presence of Escherichia coli (E. coli) O157: H7 and antimicrobial resistance in BARF (Biologically Appropriate Raw Food Diet) for dogs, marketed in different districts of Lima, Peru. 124 samples of frozen raw diets belonging to 15 different brands were analyzed, each sample from a different batch. Standard microbiological isolation was performed using MacConkey culture media, and its identification through biochemical tests; for the respective serotyping of E. coli O157, Latex test (Oxoid TSMX4147C) was used with latex particles sensitized with antibodies reactive to the somatic antigen O157 and for the identification of the H7 antigen, a similar specific Latex test was carry out (RIM E. coli O157: H7 Latex Test - Oxoid TSMX9410). The present study failed to identify E. coli O157: H7 strains within the analyzed samples; however, 65.32% (81/124) of the evaluated samples were positive for E. coli. In addition, within the E. coli positive colonies assessed, 38.18% were resistant to the 12 antimicrobials evaluated. Therefore, it was confirmed that commercial BARFs foods could serve as potential sources for contamination of multiple antimicrobial resistant E. coli. There is no evidence for the presence of E. coli serotype O157:H7 in BARF diets for dogs marketed in Lima. Keywords: Escherichia coli, O157:H7, meat, raw, diet, contamination, dog, antimicrobial, drug resistance INTRODUCCIÓN La alimentación a base de carne cruda para gatos y perros, se ha ido incrementando en los últimos años a nivel mundial (Schlesinger y Joffe, 2011); estas dietas crudas se denominan “Alimento Crudo Biológicamente Apropiado” (ACBA) o en inglés “Biologically Appropriate Raw Food” (BARF), pudiendo ser elaborados de forma casera y comercializadas. En general, se elabora a base de ingredientes crudos derivados de animales domesticados y silvestres; estos ingredientes pueden incluir músculos, órganos internos, grasa y huesos de mamíferos, peces o aves de corral; además, leche sin pasteurizar, huevos crudos y diversos vegetales (Freeman et al., 2013). Estos alimentos BARF se comercializan de forma fresca o congelada (Dadd et al., 2019; Freeman et al, 2013), siendo los congelados la presentación más comercial en el Perú. Han sido identificados múltiples beneficios de la alimentación con este tipo de dietas; como la calidad nutricional, mejor palatabilidad, dientes y encías más sanas, pelaje más brillante, mejor microbiota intestinal, heces más duras y mejora de la energía del animal (Craig, 2020). Se ha reporta que las dietas a base de alimentación cruda promueven un crecimiento más equilibrado de comunidades bacterianas, y por ende un cambio positivo para las funciones intestinales saludables (Sandri et al., 2017); sin embargo, los perros que son alimentados con este tipo de dietas, poseen un mayor riesgo de infecciones oportunistas que aquellos perros alimentados con dieta seca de formulación comercial (Kim et al., 2017). Algunas dietas BARFs posee elevados niveles de grasa, comparadas con las típicas dietas extruidas comerciales, esto mejoraría el brillo del pelaje percibido por los propietarios, pero a su vez puede causar problemas intestinales leves a severos y/o aumentar el riesgo de obesidad en los perros si se sobrealimentan con dietas altas en grasa (Freeman et al., 2013). Morelli et al. (2019) realizaron un estudio basado en encuestas, el 60% de los propietarios eligieron el tipo de alimentación cruda en base a una búsqueda de información por internet y solo 9% por medio de un veterinario; además, el 33% formulan el alimento siguiendo solo los consejos de personas por internet y el 94% de los encuestados considera el BARF completamente seguro. Un estudio similar reportó que en 39 hogares se confirmó una trasmisión de patógenos desde el alimento crudo para mascotas a los humanos. De los casos confirmados, se determinó a la Escherichia coli (E. coli) como el agente causal al hallarlo en el alimento para mascotas como en los casos humanos. Asimismo, el 75% de los que confirmaron o sospecharon de una transmisión cruzada, utilizaban el mismo lugar de manejo para la dieta cruda y para alimentos de los humanos (Anturaniemi et al., 2019). En la actualidad, existen numerosos estudios que indican los riesgos potenciales para la mascota asociados al uso de la alimentación con BARF. De las dietas crudas, solo la minoría son elaboradas por médicos veterinarios especializados en el área de nutrición; mientras que, la mayoría son preparadas de forma empírica (Morelli et al., 2019). Esto genera una nutrición desequilibrada con exceso o falta de uno o múltiples nutrientes esenciales para el animal, lo que puede ser perjudicial, particularmente en animales que se encuentran en crecimiento (Freeman et al., 2013). Los numerosos casos con deficiencias nutricionales resultan en problemas metabólicos y esqueléticos, siendo más propensos a cojeras, fracturas y deformidades como secuelas de estas; un ejemplo de esto, fue reportado en un ovejero ingles de 4 meses con signos de cojera progresiva alimentado con una dieta cruda casera desbalanceada; los análisis detectaron una hipovitaminosis D y una deficiencia de calcio, evidenciando una osteopenia difusa severa, que con ejercicio y un cambio de dieta apropiado para la edad y tamaño del perro tuvo una mejora evidente (Dadd et al., 2019). Se han reportado, que recetas elaboradas bajo esta estructura para mantenimiento de perros, el 95% presentan por lo menos un nutriente por debajo del mínimo dado por la Association of American Feed Control Officials (AAFCO), y un 83.5% contenía múltiples deficiencias (Stockman et al., 2013), posible desarrollo de hiperparatiroidismo secundario (Kohler et al., 2012 ; Taylor et al., 2009), y fractura de los dientes, lesión y/u obstrucción a nivel de la cavidad oral y a lo largo del tracto gastrointestinal (Freeman et al., 2013). El tema más discutido en la actualidad es el riesgo para la salud animal y la salud pública, debido a la posible contaminación de BARFs con agentes patógenos. La presencia y propagación de microorganismos patógenos en los alimentos, ya sea de manera directa a través de insumos contaminados, superficies, animales infectados representan un riesgo para la salud (Weese et al., 2005). Van bree et al. (2018) evaluaron 35 dietas comerciales congeladas a base de carne cruda de 8 marcas diferentes, en el 23% se aisló E. coli O157:H7 y en el 80% E. coli productoras de betalactamasas de espectro extendido, en 54% estaba presente Listeria monocytogenes (Lister, 1857), Salmonella spp (Lignieres, 1900) en 20%; además también se hallaron parásitos, en 11% Sarcocystis cruzi (Miescher, 1843) y en 6% Toxoplasma gondi (Nicolle & Manceaux, 1908); evidenciando la presencia de múltiples agentes patógenos en las dietas BARFs, llegando a ser un potencial riesgo para la salud el animal. La E. coli es un patógeno que toma gran relevancia en enfermedades trasmitidas por alimentos (ETA). La E. coli es un bacilo gramnegativo, anaerobio facultativo, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, la cual puede encontrarse como miembro comensal de la microbiota intestinal de animales y humanos. Sin embargo, algunas cepas resultan ser patógenos causales de diversas enfermedades intestinales y extra intestinales (Mainil, 2013). La presencia de E. coli patógena puede generar en el perro una colibacilosis, produciendo daño a nivel del tracto gastrointestinal, generando signos de diarreas, vómitos, pérdida de peso, deshidratación, anorexia, cuadros de shock y en casos extremos puede conllevar a la muerte del animal (Zotta et al., 2015). Aquellos serotipo de E. coli patógenos que causan daño a nivel intestinal generando el signo diarrea en el hospedador se les denomina E. coli diarreogénica, ésta a su vez se subdivide en 6 patotipos: enterotoxigénica (ECET), enteropatógena (ECEP), enteroinvasiva (ECEI), enteroagregativa (ECEA), enterohemorrágica (ECEH) y de adherencia difusa (ECAD) (Rodríguez-Angeles, 2002; Mainil, 2013). La ECEH también es conocida como productora de toxina Vero o toxina semejante a Shiga (VTEC o STEC); la cepa más frecuente de este subgrupo es la E. coli serotipo O157:H7, y la que toma más relevancia en investigaciones a nivel mundial, debido a su alta patogenicidad, y su relación en cuanto a su presencia en productos crudos de consumo humano y animal; teniendo al bovino como su principal reservorio (Rodríguez-Angeles, 2002; Saeedi et al., 2017). La resistencia bacteriana a antimicrobianos adquiere importancia debido a que puede ser adquirida por las mascotas a través del consumo de productos BARFs contaminados. Una investigación en Lima reveló un elevado nivel de resistencia de antimicrobianos en carne de pollo, res y cerdo, de mercados de abasto (Ruiz-Roldan et al., 2018). A su vez, se reportó también un alto porcentaje de resistencia en dietas crudas, donde el 62.7% de las enterobacterias aisladas eran resistentes, siendo la mayoría resistentes a cefalosporinas de tercera generación y productoras de betalactamasas de expectro extencido (BLEEs) (Nuesch-Iderbinen et al., 2019). Se plantea que los médicos veterinarios deben tomar un rol más activo en relación a la toma de decisión de los dueños en cuanto a la alimentación de su mascota; plantearles y explicarles los posibles riesgos que implica las dietas tipo BARFs. Para que la intervención del veterinario tenga más relevancia, es importante que estos médicos posean los conocimientos y la data previa necesaria para entender en su totalidad la situación epidemiológica y poder asesorar correctamente a los propietarios (Hinney, 2018). MATERIALES Y MÉTODOS Población y Muestra de estudio La población de estudio comprendió unidades de dietas comerciales BARFs congeladas, comercializadas en Lima metropolitana, obtenidas durante los meses de julio a diciembre del 2019. El tamaño de muestra se estimó utilizando un 23% de prevalencia obtenida de un estudio similar realizado en Europa (Van Bree et al., 2018), debido a que no existen estudios similares realizados en el Perú o Latinoamérica; con un 95% de confiabilidad y 5% de error; utilizándose la siguiente fórmula de presencia o ausencia (Thrusfield, 2005): 1 (𝑑−1) 𝑛 = (1 − (1 − 𝑁𝐶)𝑑) . (𝑁 − ) 2 Dónde: NC = Nivel de confianza. N = Tamaño de la población de referencia. d = Prevalencia esperada. n = Tamaño mínimo de muestra. Finalmente se obtuvo un total de 120 muestras como mínimo; sin embargo, se evaluaron 124 muestras cada muestra perteneciente a lotes distintos, las cuales fueron obtenidas de 15 marcas más comerciales disponibles en Lima, Perú. Muestreo y Lugar de Estudio El presente estudio fue de tipo observacional, prospectivo, descriptivo y transversal. Se realizó un muestreo aleatorio en el universo de muestras disponibles en comercialización. Se seleccionó como muestras a aquellos alimentos tipo BARF para perros, fabricados a base de carne cruda de diferente origen animal y diversos vegetales crudos, los cuales se encontraron de forma congelada, comercializadas vía delivery y/o en tiendas veterinarias. El aislamiento e identificación de las muestras se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Científica del Sur, localizada en Villa el Salvador, Lima, Perú. Las muestras fueron almacenadas en congelamiento (-18°C) y llevadas posteriormente al laboratorio dentro de cajas térmicas, conservando de esta manera la cadena de frio. Una vez llegado al laboratorio, las muestras fueron descongeladas siendo ubicadas en agua a temperatura ambiente. Identificación de Escherichia coli Todos los ingredientes fueron previamente homogenizados para la fabricación de las dietas BARF. La identificación de E. coli se realizó de forma convencional (INS, 2001) se tomaron 10 gr por cada muestra (ya homogenizada), y fueron puestas en un enriquecimiento previo en caldo Tripticasa de soya a 37°C por 24h; posteriormente, para su aislamiento se sembró en agar MacConkey y EMB (Eosina y Azul de Metileno agar) incubadas a 37°C por 24h. Las cepas sospechosas de E. coli fueron confirmadas través de las pruebas bioquímicas: LIA (Lisina Hierro agar), citrato de Simmons, SIM, urea y TSI (Triple Sugar Iron agar), cultivadas a 37°C por 24h. Además, algunas de las cepas confirmadas se les realizaron la tinción Gram, y fueron observadas al microscopio. Identificación de Escherichia coli serotipo O157:H7 Las cepas compatibles con E. coli fueron subcultivadas en agar MacConkey sorbitol. Las colonias que no fermentaron sorbitol (colonias incoloras) fueron aisladas y sometidas al E. coli O157 Latex Test (Oxoid TSMX4147C), el cual posee partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos específicos reactivos al antígeno somático O157. Para la serotipificación se utilizó RIM E. coli O157:H7 Latex Test (Oxoid TSMX9410), con similar mecanismo al test antes mencionado, resultando positivo la aglutinación. Identificación de Resistencia a Antimicrobianos Las cepas positivas a E. coli confirmadas mediante las pruebas bioquímicas, fueron almacenadas en crioviales con caldo Tripticasa de soya, hasta ser nuevamente analizadas. Se determinó la sensibilidad antimicrobiana frente a 12 fármacos, mediante el método de difusión en disco (método Kirby-Bauer), siguiendo el modelo de la guía CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Los antimicrobianos fueron: Ac. Nalidíxico (30ug/ml), Azitromicina (15ug/ml), Imipenem (10ug/ml), Cotrimoxazol (25ug/ml), Gentamicina (10ug/ml), Cloranfenicol (30ug/ml), Amoxicilina con ac. Clavulánico (30ug/ml), Ciprofloxacina (5ug/ml), Furazolidona (100 ug/ml), Nitrofurantoina (300ug/ml), Ampicilina (10ug/ml) y Tetraciclina (30ug/ml) (Cuadro 1). Se sembró las cepas en agar Muller Hinton, posteriormente se ubicaron 6 discos en cada placa, y se incubó nuevamente a 37°C por 24h. RESULTADOS El 65.32% (81/124) con un IC95%: 56.9% – 73.7% de las muestras analizadas fueron positivas a E. coli; sin embargo, no se logró identificar ninguna cepa E. coli serotipo O157:H7; de las cuales 8 marcas presentaron por lo menos el 80% de positivos a E. coli (Cuadro 1). Cuadro 1: Frecuencia de presentación de positivos de E. coli según el número de muestras por marca de alimento tipo BARFs comerciales de Lima, 2019 N° N° IC 95% Marca %* muestras positivos Mínimo Máximo D 10 10 100.00 100.00 100.00 L 9 9 100.00 100.00 100.00 M 9 9 100.00 100.00 100.00 C 2 2 100.00 100.00 100.00 F 2 2 100.00 100.00 100.00 N 9 8 88.89 68.36 100.00 J 7 6 85.71 59.79 100.00 Ñ 10 8 80.00 55.21 100.00 A 10 7 70.00 41.60 98.40 G 9 6 66.67 35.87 97.46 I 9 4 44.44 11.98 76.91 K 9 4 44.44 11.98 76.91 B 10 3 30.00 1.60 58.40 H 9 2 22.22 0.00 49.38 E 10 1 10.00 0.00 28.59 Total 124 81 65.32 56.95 73.70 * Porcentaje de positivos según el número de positivos del número de muestras totales por marca De los insumos, la carne de res fue el tipo de proteína más utilizada y evaluada, el 73.33% (22/30) resultó positivo; el pollo un 38.10% positivo (8/21); y el pavo 85.71% (12/14) (Cuadro 2). Cuadro 2: Frecuencia de muestras positivas a E. coli según el total de muestras por cada tipo de proteína utilizada en el alimento tipo BARF comerciales de Lima, 2019 Tipo de proteína N° N° IC 95% %* animal muestras positivos Mínimo Máximo Res 30 22 73.33 57.51 89.16 Res y pavo 22 13 59.09 38.55 79.64 Pollo 21 8 38.10 17.33 58.87 Pavo 14 12 85.71 67.38 100.00 Res y pollo 11 8 72.73 46.41 99.05 Res y cerdo 9 7 77.78 50.62 100.00 Pollo, pavo y pato 5 5 100.00 100.00 100.00 Pavo y pato 4 1 25.00 0.00 67.43 Res y equino 3 3 100.00 100.00 100.00 Cordero 3 1 33.33 0.00 86.68 Res, pavo y pollo 1 1 100.00 100.00 100.00 Pavo y pollo 1 0 0.00 0.00 0.00 Total 124 81 65.32 56.95 73.70 * Porcentaje de positivos según el número de positivos del número de muestras totales por proteína Del total de muestras positivas a E. coli, el 38.18% del total de colonias evaluadas resultaron resistentes y el 17.04% intermedias. En Ampicilina, Cotrimoxazol, Ac. Nalidixico y Cloranfenicol se encontró un porcentaje de resistencia superior al 50%, en Tetraciclina, Furazolidona e Imipenem superior al 30%. Solo una colonia evaluada contra Azitromicina resulto resistente, todas las demás fueron sensibles (Cuadro 3). Cuadro 3: Frecuencia de la resistencia a antimicrobianos de las cepas de Escherichia coli aislados en BARFs comerciales de Lima, 2019 Sensible Intermedio Resistente Antimicrobiano n %* n %* n %* Ampicilina 7 10.45 14 20.90 46 68.66 Cloranfenicol 3 4.48 19 28.36 45 67.16 Ácido nalidíxico 10 14.93 16 23.88 41 61.19 Cotrimoxazol 23 34.33 5 7.46 39 58.21 Tetraciclina 30 44.78 4 5.97 33 49.25 Imipenem 22 32.84 20 29.85 25 37.31 Furazolidona 26 38.81 19 28.36 22 32.84 Ciprofloxacina 43 64.18 4 5.97 20 29.85 Gentamicina 46 68.66 8 11.94 13 19.40 Nitrofurantoina 35 52.24 21 31.34 11 16.42 Amoxicilina Ácido clavulánico 49 73.13 7 10.45 11 16.42 Azitromicina 66 98.51 0 0.00 1 1.49 Total 360 44.78 137 17.04 307 38.18 *Porcentajes calculado sobre el número total de colonias positivas evaluadas ''Número total de colonias evaluadas calculado sobre la suma de todos los n por cada antimicrobiano DISCUSIÓN El presente estudio no identificó cepas E. coli O157:H7 en las muestras analizadas; sin embargo, a nivel de Latinoamérica se han reportado prevalencias de E. coli O157:H7 productora de toxina Shiga en productos cárnicos de res de 1.4% y 3.5%, en Argentina y Brasil, respectivamente (Morato et al., 2007; Jure et al., 2015), y 1.54% en carne molida en el Perú (Mendez et al., 2013). A nivel mundial, en Turquía y Etiopia se reportó 1.94% y 10.2% en carne de pollo y en carne de res, oveja y cabra, respectivamente (Bekele et al., 2014; Dincoglu et al., 2016), en España en preparados cárnicos y en Sudáfrica en carne seca, carne picada y embutidos se aisló con 19.41% y 2.8%, respectivamente (Abong´o y Momba, 2009; Ripodas et al., 2017). Los reportes de hallazgos en diversos países, confirma la alta posibilidad y el potencial riesgo de la presencia del serotipo antes mencionado; por lo que, el uso de una técnica más sensible, otras circustancias de muestreo, o un mayor número de muestras analizadas hubiese permitido el aislamiento de las cepas E. coli O157:H7. Llanos et al. (2012) reportaron que el 9.2% de los niños con cuadros de diarrea sanguinolenta evaluados en el Perú se asociaron a E. coli productora de toxina Shiga, demostrando el riesgo permanente que este patógeno representa, tras la posible contaminación de las dietas crudas de las mascotas, puede ser también una ruta de transmisión al humano, generando un riesgo para la salud pública. El 65.32% (81/124) con un IC95%: 56.9% – 73.7% de las muestras que resultaron positivos a E. coli en el presente estudio se encuentra dentro del rango de resultados reportados en muestras de mercados de abasto de la ciudad de Lima, 87.18% positivos en muestras de carne molida (Mendez et al., 2013) y 42% de puestos de venta de carne de pollo (Lucas et al., 2016). Esto representa un riesgo importante, pues la mayoría de insumos necesarios para la elaboración del BARFs son adquiridos en este tipo de mercados. A su vez, Weese et al. (2005) reportó que los coliformes fueron hallados en todas las muestras de dieta cruda comercial analizadas, donde Escherichia coli fue identificada en 64%, similar al reporte del presente estudio. En años posteriores, se reportó un porcentaje aún más elevado de aislamiento de E. coli (86%) en dietas crudas congeladas comerciales (Van Bree et al., 2018). En la totalidad de muestras en 5 marcas evaluadas se aisló E. coli como contaminante, pese a que cada muestra provenía de diferente lote; esto posiblemente se debe, a que los insumos se encuentran ya contaminados desde el puesto de venta donde se adquirieron (los mercados de abasto antes mencionados), o que en uno o varios puntos de la cadena de producción haya un mal manejo o equipos contaminados, representando un riesgo permanente de contaminación. El gran porcentaje de positivos (65.32%) a E. coli puede deberse a que las dietas BARFs son productos altamente manipulados, incrementando de esta manera el riesgo a la exposición de agentes patógenos. La carne molida, base de la mayoría de las dietas evaluadas, por su gran manipulación fueron aún más susceptible a la contaminación microbiana; además, al ser un producto procesado y triturado, generó la destrucción de las facias protectoras y esto aumentó las posibles superficies de contaminación (Mendez et al., 2013), otros factores que potencialmente influyen es la cadena de frio necesaria para una adecuada conservación de las mismas. Según el tipo de fuente animal, la carne de res fue el tipo de proteína en las dietas BARFs más analizada en este estudio, pese a que no fue reportado el serotipo deseado, y el bovino estar considerado el principal reservorio para la E. coli O157:H7; se obtuvo un 73.33% de muestras positivas a E. coli, mayor a lo reportado en el estudio de Strohmeyer et al. (65.74%). Por otro lado, la carne de aves de corral, también ingredientes muy utilizados en las dietas crudas, se convierte en posible fuente de contaminación, debido a una potencial la contaminación cruzada durante su manipulación (Lucas et al., 2016); corroborado por reportes altos de esta bacteria en el tipo de proteína de las aves de corral, 85.71% en carne de pavo, 38.1% en carne de pollo (Strohmeyer et al., 2006). No solo los productos de origen animal son una fuente de contaminación, un estudio realizado en Lima reportó que el 18,9% de verdura fresca presentaron niveles de E. coli fecales superior a lo establecido como apto por la ICMSF (International Commission on Microbiological Specification for Foods), siendo la espinaca la más contaminada (Muñoz et al., 2013), la cual fue ingrediente de varios BARFs evaluados en el presente estudio. Las muestras evaluadas a pesar de estar almacenadas a -18°C, no afecto el aislamiento de la E. coli; un estudio reportó que la E. coli O157:57 es capaz de sobrevivir en carne molida a una temperatura de 7°C por 11 días y a -18°C por 35 días (Uyttendaele et al., 2001); concluyendo, que el congelamiento no sería una forma de afectar la contaminación con esta bacteria y esto representa el potencial riesgo de exposición a para aquellas personas que manipulan directamente dietas BARFs contaminadas (Weese et al., 2005); siendo reportados estos casos positivos en humanos (Anturaniemi et al., 2019), y posibilitando por el contacto con los animales una potencial zoonosis. El presente estudio reportó un 38.18% de nivel de resistencia a 12 antimicrobianos evaluados, porcentaje mayor al reportado por Nilsson (2015), donde en 23% de las muestras de dietas crudas para perros se aisló E. coli resistente a cefalosporinas de espectro extendido, productoras de betalactamasas de espectro extendido en el 80% de dietas crudas evaluadas (Van Bree et al., 2018), y los reportes de E. coli aisladas de carnes de pollo y cerdo en de mercados en Lima, con altos niveles de resistencia a múltiple antimicrobianos (MDR). Ampicilina fue el antimicrobiano con el mayor nivel de resistencia (68.66%), porcentaje inferior a los reportados años anteriores con 94.6% en carne de pollo y en carne de cerdo con 95.4%, y superior al 44% en carne de res (Ruiz-Roldan et al., 2018). Segundo en nivel de resistencia está el Cloranfenicol (67.16%), porcentaje inferior al encontrado en carne de pollo con 82.1% y superior en carne de res con 4% y en carne de cerco con 54.5% (Ruiz-Roldan et al., 2018); un estudio reportó que en el 52% de las heces analizadas se aisló E. coli productora de betalactamasa de espectro extendido de perros alimentados con dieta cruda, a diferencia del 4 % aislado en aquello con dietas secas (Runesvard et al., 2020). Reportando una asociación entre la posible contaminación bacteriana de las dietas y la expulsión de estos agentes resistentes por medio de las heces. Estos resultados indican que este tipo de dietas puede ser una fuente potencial de agentes resistente a fármacos de primera elección (Nilsson, 2015). A diferencia de los alimentos de consumo humano, no hay una autoridad especifica que sea responsable del monitoreo microbiológico constante de los alimentos para perros a base de productos crudos como las dietas tipo BARFs (Strohmeyer et al., 2006). En el Perú, el Servicio Nacional de Sanidad Agraria (SENASA), es la entidad encargada de la inocuidad agroalimentaria, mas no posee reglamentación específica para las dietas crudas para mascotas; exponiendo a estos animales a este tipo de prácticas. La ausencia de positivos para la cepa O157:H7 en este estudio, pudo ser distinto con la utilización de otro tipo de serotipificación, utilizados en otros estudios, como separación inmunomagnética (Jure et al., 2015), test de concentración por inmunocaptura (Marzocca et al., 2006) o molecularmente mediante PCR (Mora et al., 2006; Mendez et al., 2013; Lucas et al., 2016); los reportes antes mencionados respaldan la presencia de esta bacteria en diversos productos cárnico. El aumento creciente de propietarios que deciden alimentar a sus perros con dietas BARFs justifica mayores investigaciones de este tipo de dietas. Análisis y reportes de aislamiento de patógenos de las dietas crudas junto con el seguimiento a aquellos perros que son alimentados con ellas (Strohmeyer et al., 2006). CONCLUSIONES En el 100% de las muestras evaluadas de alimentos tipo BARF no se logró aislar E. coli serotipo O157:H7. En el 65.32% (81/124) con un IC95%: 56.9% – 73.7% de las muestras analizadas de alimento tipo BARF se aisló E. coli. El 100 % de las cepas presentan resistencia a al menos a un antimicrobiano evaluado, siendo la resistencia a la ampicilina la frecuencia más alta con un 68.66% (46/67) y la frecuencia más baja correspondió a la azitromicina con un 1.49% (1/67). LITERATURA CITADA 1. Abong´o BO, Momba MN. 2009. Prevalence and characterization of Escherichia coli O157:H7 isolates from meat and meat products sold in Amothe district, Eastern Cape province of South Africa. Food Microbiology 26: 173-176. doi: doi:10.1016/j.fm.2008.10.001 2. Anturaniemi J, Barrouin-Melo SM, Zaldivr-López S, Sinkko H, Hielm-Bjorkman A. 2019. Owners’ perception of acquiring infections through raw pet food: a comprehensive internet-based survey. Vet Record. doi:10.1136/ vetrec-2018-105122 3. Bekele T, Zewde G, Tefera G, Feleke A, Zerom K. 2014. Escherichia coli O157:H7 in raw meat in Addis Ababa, Ethiopia: Prevalence at an abattoir and retailers and antimicrobial susceptibility. International Journal of Food Contamination 1:4. doi: 10.1186/s40550-014-0004-9 4. Craig JM. 2020. Raw feeding in dogs and cats. Companion animal 24 (11): 578-584. https://doi.org/10.12968/coan.2018.0068 5. Dadd S, Barry M, Grant C, Verbrugghe A. 2019. Abnormal bone mineralization in a puppy fed an imbalanced raw meat homemade diet diagnosed and monitored using dualenergy X‐ray absorptiometry. J Anim Physiol Anim Nutr 00: 1-8. doi: 10.1111/jpn.13118 6. Dincoglu AH, Gunulalan Z. 2016. Determination of Escherichia coli O157:H7 in chicken meats sold in Sanliurfa región. MJEN 4: 25-68. 7. Freeman LM, Chandler ML, Hamper BA, Weeth LP. 2013. Current knowledge about the risks and benefits of raw meat–based diets for dogs and cats. JAVMA, Vol 243, No. 11: 1549-1558. 8. Hinney B. 2018. The trend of raw meat-based diets: risks to people and animals. Vet record 182: 47-49. Doi: 10.1136/vr.k7 9. INS. 2001. Manual de procedimientos bacteriologicos en infecciones intrahospitalarias. Serie de norma técnica 28, 89p. 10. Jure MA, Condorí MS, Perez G, Catalan M, López A, Zolezzi G, et al. 2015. Aislamiento y caracterización de Escherichia coli O157 en productos cárnicos bovinos y medias reses en la provincia de Tucumán. Rev Argent Microbiol 47 (2): 125-131. http://dx.doi.org/10.1016/j.ram.2015.03.006 11. Kim J, An J, Kim W, Lee S, Cho S. 2017. Differences in the gut microbiota of dogs (Canis lupus familiaris) fed a natural diet or a commercial feed revealed by the Illumina MiSeq platform. Gut Pathog 9:68. doi 10.1186/s13099-017-0218-5 12. Kohler B, Stengel C, Neiger R. 2012. Dietary hyperthyroidism in dogs. JSAP 53: 182-184. doi: 10.1111/j.1748-5827.2012.01189.x 13. Llanos A, Lee J, Lopez F, Contreras C, Barletta F, Chea-Woo E, et al. 2012. Shiga Toxin- Producing Escherichia coli in Peruvian Children with Bloody Diarrhea. Pediatr Infect Dis J 31(3): 314–316. doi:10.1097/INF.0b013e318244000c. 14. Lucas JR, Morales S, Salazar EP, Eslava C, Alvarado D. 2016. Contaminación por Escherichia coli Shigatoxigénica en Puestos de Expendio de Carne de Pollo en un Distrito de Lima. Rev Inv Vet Perú 27(3): 618-625. http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v27i3.12000 15. Mainil J. 2013. Escherichia coli viruence factors. Veterinary Immunology and Immunopathology 152: 2 - 12. http://dx.doi.org/10.1016/j.vetimm.2012.09.032 16. Mendez CR, Vergaray G, Morante HY, Flores PR, Gamboa RA. 2013. Aislamiento y caracterización de Escherichia coli O157:H7 a partir de carne molida de bovino en Lima-Perú. Rev. peru. biol. 20(2): 159-154. 17. Mora A, Leon SL, Blanco M, Blanco JE, Lopez C, Dahbi G, et al. 2006. Phages types, virulence genes and PFGE profiles of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7 insolated from raw beef, soft cheese and vegetables in Lima (Peru). Intertational Journal of Food Microbiology 114: 204-210. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2006.09.009 18. Morelli G, Bastianello S, Castellani P, Ricci R. 2019. Raw meat-based diets for dogs: survey of owners’ motivations, attitudes and practices. BMC Veterinary Research 15:74. https://doi.org/10.1186/s12917-019-1824-x 19. Morato AM, Simoes M, Irino K, Tardelli TA, Cabilio BE. 2007. Prevalence and characteristics of shiga toxin-producing Escherichia coli (stec) strains in ground beef in São Paulo, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology 38: 553-556. 20. Marzocca MA, Marucci PL, Sica MG, Álvarez EE. 2006. Detección de Escherichia coli O157:H7 en carne picada fresca y hamburguesas congeladas. Revista Argentina de Microbiología 38: 38-40. 21. Muñoz S, Vilca M, Ramos D, Lucas J. 2013. Frecuencia de enterobacterias en verduras frescas de consumo crudo expendidas en cuatro mercados de Lima, Perú. Rev Inv Vet Perú 24(3): 300-306. 22. Nilsson O. 2015. Hygiene quality and presence of ESBL-producing Escherichia coli in raw food diets for dogs. Infection Ecology and Epidemiology 5: 28758. http://dx.doi.org/10.3402/iee.v5.28758 23. Nuesch-Inderbinen M, Treier A, Zurfluh K, Stephan R. 2019. Raw meat-based diets for companion animals: a potential source of transmission of pathogenic and antimirobial- resistant Enterobacteriaceae. R. Soc. open sci. 6: 191170. http://dx.doi.org/10.1098/rsos.191179 24. Ripodas A, Fernández D, Macho M. 2017. Investigación de Escherichia Coli productor de toxinas Shiga (STEC) en carnes y derivados cárnicos. Sanidad mil. 73 (3): 147-152. doi: 10.4321/S1887-85712017000300002 25. Rodríguez-Angeles G. 2002. Principales características y diagnóstico de los grupos patógenos de Escherichia coli. Salud Pública Mex 44(5): 464-475. 26. Ruiz-Roldán L, Martínes-Puchol S, Gomes C, Palma N, Riveros M, Ocampo K, et al. 2018. Presencia de Enterobacteriaceae y Escherichia coli multirresistente a antimicrobianos en carne adquirida en mercados tradicionales en Lima. Rev Peru Med Exp Salud Pública 35(3): 425-32. 27. Runesvard E, Mikstrom C, Fernstrom L, Hansson I. 2020. Presence of pathogenic bacteria in faeces from dogs fed raw meat- based diets or dry kibble. Vet Record. doi:10.1136/ vetrec-2019-105644 28. Saeedi P, Yazdanparast M, Behzadi E, Hatef A, Latif S, Nazarian S. 2017. A review on strategies for decreasing E. coli O157:H7 risk in animals. Microbial Pathogenesis 103: 186-195. http://dx.doi.org/10.1016/j.micpath.2017.01.001 29. Sandri M, Dal Monego S, Conte G, Sgorlon S, Stefanon B. 2017. Raw meat based diet influences faecal microbiome and end products of fermentation in healthy dogs. BMC Veterinary Research 13:65. doi: 10.1186/s12917-017-0981-z 30. Schlesinger DP, Joffe D. 2011. Raw food diets in companion animals: A critical review. Can Vet J 52: 50-54. 31. Stockman J, Fascetti AJ, Kass PH, Larsen JA. 2013. Evaluation of recipes of home- prepared maintenance diets for dogs. JAVMA 242(11): 1500-1505. 32. Strohmeyer RA, Morley PS, Hyatt DR, Dargatz DA, Scorza V, Lappin MR. 2006. Evaluation of bacterial and protozoal contamination of commercially available raw meat diets for dogs. JAVMA 228(4): 537-542. 33. Taylor MB, Geiger DA, Saker KE, Larson MM. 2009. Diffuse osteopenia and myelopathy in a puppy fed a diet composed of an organic premix and raw ground beef. JAVMA 234(8): 1041-1048. 34. Uyttendaele M, Vankeirsbilck S, Debevere J. 2001. Recovery of heat-stressed E. coli O157:H7 from fround beef and survival of E. coli O157:H7 in refrigerated and frozen groun beef and in fermented sausage kep at 7°C and 22°C. Food Microbiology 18: 511- 519. doi:10.1006/fmic.2001.0445 35. Van Bree FP, Bokken GC, Mineur R, Franssen F, Opsteegh M, van der Giessen J, et al. 2018. Zoonotic bacteria and parasites found in raw meat-based diets for cats and dogs. Vet Record. doi: 10.1136/vr.104535 36. Weese JS, Rousseau J, Arroyo L. 2005. Bacteriological evaluation of commercial canine and feline raw diets. Can Vet J 46: 513-516. 37. Zotta CM, Lavayén S, Hollman P, Lanfranconi V. 2015. Animales Domésticos Como Reservorio De Escherichia coli Productor De Toxina Shiga En Mar del Plata. J. Selva Andina Res. Soc. 6(1): 2-9.