FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y BIOLÓGICAS CARRERA PROFESIONAL DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA “DISEÑO Y VALIDACIÓN DE PRIMERS PARA EL GEN ADAM2 EN ALPACAS” Tesis para optar el título de: MÉDICO VETERINARIO y ZOOTECNISTA Presentado por: Silvana Caridad Moscol Fernández (https://orcid.org/0000-0003-4127-9936) Asesor: Shirley Sujey Evangelista Vargas (https://orcid.org/0000-0001-6105-1889) Lima – Perú 2020 DISEÑO Y VALIDACIÓN DE PRIMERS PARA EL GEN ADAM2 EN ALPACAS DESIGN AND VALIDATION OF PRIMERS FOR THE ADAM2 GENE IN ALPACA Silvana Moscol-Fernández1; Shirley Evangelista-Vargas1,2 RESUMEN La alpaca es un animal de importancia socioeconómica para los ganaderos de la zona altoandina del Perú. Actualmente, se buscan métodos para la selección temprana de machos reproductores, para esto sería interesante identificar genes relacionados con la fertilidad espermática. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue diseñar primers para el gen ADAM2 en alpacas mediante el programa bioinformático Primer3 y validarlos usando la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) convencional. Se diseñaron 32 pares de primers, de estos se seleccionaron y se mandaron a sintetizar dos pares, denominados ADAM2-A21 y ADAM2-A22 con 328 y 497 pares de bases (pb) respectivamente. Usando PCR convencional se amplificó los fragmentos de ADN, los amplicones obtenidos se corrieron en electroforesis horizontal, usando gel agarosa al 1.2%, y las bandas obtenidas se visualizaron utilizando un fotodocumentador; los productos obtenidos a través de PCR coincidieron en tamaño de pares de bases con los primers diseñados in silico. Se concluyó que es posible el diseño de primers para el gen ADAM2 en alpacas mediante programas bioinformáticos y su validación usando la técnica de PCR. Palabras clave: Diseño de primers, ADAM2, alpacas ABSTRACT The alpaca is an animal of socioeconomic importance for farmers in the high Andean area of Peru. Currently, methods are sought for early selection of breeding males, for this, it could be interesting to identify genes related to sperm fertility. Therefore, the objective of this work was to design primers for the ADAM2 gene in alpacas using the Primer3 bioinformatic program and validate them using the conventional Polymerase Chain Reaction (PCR) technique. 32 pairs of primers were designed, two pairs of these were selected and ordered to be synthesized, called ADAM2-A21 and ADAM2-A22 with 328 and 497 base pairs (bp) respectively. The DNA fragments were amplified using conventional PCR, the obtained amplicons were run in horizontal electrophoresis, using 1.2% agarose gel, and the bands obtained were visualized using a photodocumenter; the products obtained through the PCR coincided in size of base pairs with the primers designed in silico.it was concluded that it is possible to design primers for the ADAM2 gene in alpacas through bioinformatic programs and its validation using the PCR technique. Key words: Primer design, ADAM2, alpacas 1 Laboratorio de Biotecnología Reproductiva y Celular, Facultad de Ciencias Veterinarias y Biológicas, Universidad Científica del Sur, Lima, Perú 2 Email: sevangelista@cientifica.edu.pe INTRODUCCIÓN La alpaca es un camélido sudamericano doméstico que sirve como fuente de ingreso económico para las familias altoandinas del país, como fuente productiva de fibra y carne, ya que está adaptado para sobrevivir alimentándose a base de las pasturas naturales de baja calidad nutricional que crecen en estas zonas (Fernández-Baca, 2005). Por décadas se ha buscado realizar proyectos de selección y mejora genética en esta especie; sin embargo, la selección de los reproductores que han participado en este tipo de programas se ha realizado tomando en cuenta características fenotípicas y de forma muy superficial, tomando en cuenta las características reproductivas (García, 2005). Este tipo de selección generalizada en el país, considera machos reproductores a partir de los 3 años de edad, considerándose este parámetro uno de los principales factores que ocasiona el retraso en el proceso de selección y un aumento en el intervalo generacional. En la actualidad, en otras especies de producción como los bovinos, se realiza la selección de reproductores empleando marcadores moleculares (Singh et al., 2014), utilizar esta metodología permitiría la selección temprana de machos reproductores, enfocada en la predicción de parámetros espermáticos ideales para una adecuada fecundación. Como parte de la evaluación de los genes implicados en la fertilidad espermática, se ha identificado, como uno de los más importantes, al gen ADAM2 (Wyckoff et al., 2000). Este gen, conocido como Fertilin beta o PH-30, pertenece a la familia A Desintegrin And Metalloprotease (ADAM), cuyos miembros codifican proteínas transmembrana ubicadas en distintos tipos celulares de una gran cantidad de tejidos en mamíferos (Day et al., 2003; Seals et al., 2003; Cho, 2012), en los que cumplen funciones de miogénesis, espermatogénesis, fertilidad, adhesión en células somáticas, entre otros (Primakoff et al., 2000). Este gen ha sido estudiado en muchas especies como: humanos, roedores, lagomorfos, bovinos, porcinos, entre otros (Perry et al., 1995; Burkin et al., 1996; Hardy et al., 1996; Waters et al., 1997; Day et al., 2003; Choi et al., 2016; Giebeler et al., 2016). Además, se ha determinado en ratones, que la ausencia total o parcial del gen produce individuos sanos, pero infértiles, específicamente en la deleción del exón 14 (Cho et al., 1998; Nishimura et al., 2007). Según la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI), el gen ADAM2 (ID: 102529822) se ubica en el cromosoma 26 entre el nucleótido 11199114 y el 11268514 del genoma de la alpaca. Este gen expresa una proteína denominada de la misma manera, cuya función principal es mantener la estabilidad estructural de otras proteínas de la misma familia al formar dímeros con estas (Nishimura et al., 2007). Mediante estudios en monos, se ha determinado que el precursor de la proteína ADAM2 (100 kDa) se encuentra en las células germinales del testículo, este pasa por un proceso de proteólisis durante la maduración espermática que se realiza en el epidídimo, durante este proceso pierde el prodominio y el dominio metaloproteasa llegando a su maduración (47 kDa), donde deja expuesto el dominio desintegrina en el extremo N-terminal (Kim et al., 2010). La proteína ADAM2 forma complejos diméricos con los siguientes miembros de su familia: ADAM1, ADAM3, ADAM4, ADAM5 y ADAM6. Gracias a estudios en ratones knockout para el gen ADAM2, se determinó que la ausencia de la proteína no permite la formación del complejo ADAM1b-ADAM2 y esto genera espermatozoides incapaces de migrar del útero al oviducto (Cho, 2012; Muro et al., 2011). Okabe et al. (2014) postula que al formarse el heterodímero ADAM1a-ADAM2 permite la presencia del ADAM3 en la superficie del espermatozoide, y este último al formar un dímero con la proteína ADAM2 tiene funciones importantes en la reproducción como la agregación espermática y la unión del espermatozoide- ovocito (Choi et al., 2016). La fecundación se da por la unión de la desintegrina espermática, perteneciente a la proteína ADAM2 en su forma madura, a la integrina (α6β1) del ovocito (Giebeler et al., 2016). Debido a la importancia del gen sobre la fertilidad en otras especies, sería relevante estudiarlo en alpacas; sin embargo, en la base de datos del NCBI solo se encontró la secuencia incompleta del gen con aproximadamente 69401 pares de bases (pb) sumado a esto, no se proporciona información suficiente para identificar la secuencia de los primers empleados. Por lo tanto, el objetivo del trabajo es diseñar primers para el gen ADAM2 en alpacas y validarlos mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa convencional o, conocida por sus siglas en inglés, PCR convencional. MATERIALES Y MÉTODOS Se recuperó las secuencias del gen (ID: 102529822) y la variante 1 de ARNm (Código de acceso: XM_031691545.1) de ADAM2 en alpacas de la base de datos de la NCBI; las cuales fueron alineadas utilizando el programa Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Luego se diseñaron primers in silico mediante el programa Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/), utilizando como molde la secuencia del gen ADAM2 en alpacas. De los 69401 pb que presenta la secuencia, se emplearon un aproximado de 27000 pb, debido a que se evitaron las zonas no identificadas. De las zonas seleccionadas, se tomaron fragmentos de aproximadamente 10 – 20 kb, los cuales fueron ingresados al programa para generar primers que fueron seleccionados según los criterios mencionados en el Cuadro 1. Además, se evaluó la formación de subproductos (horquillas y dímeros) in silico mediante el programa OligoAnalyzer 3.0 de Integrated DNA Technologies (https://www.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer). Se alinearon los primers diseñados con las secuencias trabajadas al inicio, de esta manera fue posible determinar la ubicación de estos con respecto a la secuencia del gen y en que exón o intrón se encontraban. Se emplearon un total de 20 muestras de tejido testicular procedente de 10 individuos. Para ello, se obtuvieron testículos del Camal Municipal de Huancavelica, a los cuales se les retiró la túnica vaginal visceral, y lavó con suero fisiológico al 0.9%. Cada par de testículos, de un mismo individuo, fueron colocados en una bolsa plástica y conservados en cajas refrigeradas a 5 ºC para su transporte inmediato a Lima Cada par de testículos, de un mismo individuo, fueron colocados en una bolsa plástica y conservados en cajas refrigeradas a 5 ºC para su transporte inmediato a Lima (Banda et al., 2010). En el laboratorio de Biotecnología Reproductiva y Celular de la Universidad Científica del Sur (Villa El Salvador, Lima) se realizó la extracción ADN, Utilizando para ello el kit comercial innuPREP DNA Mini Kit (Analytik Jena AG). Mediante este kit se obtiene ADN generando la lisis de la membrana celular y nuclear para liberar el contenido, posteriormente es necesario realizar dos pasos de lavado para disminuir los contaminantes (ARN, proteínas, etc.) y en el último paso se disminuyó a la mitad el volumen de elución a diferencia de lo indicado por el manual. Para fines de este trabajo se consideró como validación que el tamaño de los amplicones coincida con el tamaño en pares de bases obtenidos en el programa Primer3. El ADN extraído se mezcló con el reactivo innuMIX Standard PCR MasterMix (Analytik Jena AG) para preparar la PCR convencional. La técnica se realizó en un termociclador Thermal Cycler 0.2ml x 64 PCR- 300 (mcr), aplicando el siguiente protocolo: 1 ciclo de desnaturalización inicial de 95ºC por dos minutos, 40 ciclos de 95ºC de 40 segundos, 58ºC de 40 segundos, 72ºC de 40 segundos y finalmente, elongación final 72ºC de 10 minutos. Los productos obtenidos de la amplificación se corrieron en gel agarosa al 1.2% mediante la técnica de electroforesis horizontal. Se utilizó una cámara de electroforesis horizontal de 10 x 10 (ENDURO) y buffer de corrida TAE 1X (Cleaver Scientific). Para la visualización de los fragmentos amplificados se utilizó buffer de tinción SafeView Classic (abm) y se utilizó el marcador de peso molecular comercial de 1kb (Ladder Express de Analytik Jena). Las condiciones de corrida de electroforesis fueron de 40 minutos a 90 voltios y, finalmente los geles fueron fotografiados por un fotodocumentador (ENDURO). Cuadro 1. Criterios para el diseño de primers Criterio Descripción Tamaño Tamaño ideal: 20-25 nucleótidos de longitud Generalmente: 18-30 nucleótidos de longitud Base en el extremo 3’ Debe ser una G o una C Temperatura melting (Tm) 50-65 ºC Contenido %GC 40-60% Auto-complementariedad Debe ser evitada para minimizar la formación de estructuras secundarias y los dímeros de primer Similaridad Debe tener 100% de apareamiento con el molde Fuente: Orozco-Ugarriza (2016) RESULTADOS En la base de datos de la NCBI se identificó que la secuencia de ADN del gen ADAM2 descrita en alpacas presenta aproximadamente 69401 pb y 24 exones. Mediante el alineamiento de las secuencias del gen ADAM2 y ARNm fue posible determinar la ubicación de los exones dentro de la secuencia del gen. Cumpliendo los criterios establecidos en el Cuadro 1, se seleccionaron 32 posibles pares de primers (Cuadro 2) de los diseñados mediante el programa Primer 3, todos estos eran candidatos válidos para ser sintetizados. Se empleó un muestreo no probabilístico aleatorio para seleccionar dos pares de primers, el 32 y 28 a los cuales se les denominó ADAM2-A21 y ADAM2-A22 respectivamente. Estos fueron sometidos a una evaluación de horquillas y dímeros como se observa en el Cuadro 3, para determinar la calidad de los productos. Finalmente estos fueron alineados con las secuencias anteriormente mencionadas y se determinó que el primer forward de ADAM2-A21 está ubicado entre los nucleótidos 62886 y 62906 tomando parte del exón e intrón 19 de la secuencia de ADAM2 en alpaca, y el primer reverse entre el 63194 y 63214 encontrándose en el intrón 19; de la misma manera se trabajó en los primers del ADAM2-A22, el forward se ubica entre los nucleótidos 55866 y 55886, y el reverse entre el 56343 y el 56363, ambos se encuentran en el intrón 15 (Figura 1-4). En la Figura 5 se observa los amplicones obtenidos para el par de primers ADAM2-A21. La Figura 6 corresponde a los amplicones del par de primers ADAM2-A22. En ambos, el tamaño de los amplicones coincide con el tamaño de producto obtenido en el software Primer3, de 328 y 497 pb para ADAM2-A21 y ADAM2-A22 respectivamente. El orden de los carriles está distribuido de igual forma en los dos geles, siendo la siguiente: Carril M: marcador de peso molecular, Carril 1 y Carril 2: amplicones de la muestra Nº 1 de ADN, Carril 3 y Carril 4: amplicones de la muestra Nº 2 de ADN, Carril 5 y Carril 6: amplicones de la muestra Nº 3 de ADN, Carril 7: amplicón de la muestra Nº 4 de ADN y, Carril 8: blanco o control negativo (-); los carriles 2, 4 y 6 se corrieron con el fin de demostrar la repetibilidad de la prueba. Cuadro 2. Secuencias y características de los primers diseñados mediante el programa Primer3 para el gen ADAM2 en el genoma de la alpaca Tamaño de amplicón # Primer Secuencia (5’ A 3’) Longitud Tm (ºC) %GC Ubicación (pares de bases-pb) Forward TGCGTTAAAAGACCCCAAAG 20 60.10 45 Intrón 1 306 1 Reverse CAAAAGGCAGGGTTGAAGAA 20 60.22 45 Intrón 1 Forward CTGAGTTGAAGCCTCCGTCT 20 59.60 55 Exón 2 460 2 Reverse GTCCCAAGAACAGTGGGAAA 20 59.94 50 Intrón 2 Forward GCAGTCAGAAGGTCCAAAGG 20 59.84 55 Intrón 2 308 3 Reverse TTGCACACGTAGCCTTTCAG 20 60.05 50 Intrón 2 Forward TGGAGGAGTTGAATCACAGG 20 58.64 50 Exón 3 327 4 Reverse CAAATATTGCCCCCTGAGTG 20 60.32 50 Intrón 3 Forward TTGCTGGCTGTTCATTTGTC 20 59.85 45 Intrón 4 376 5 Reverse CTTTTCCCAGATCCATCAGC 20 59.63 50 Intrón 4 Forward CCAGGAGAGGCTCTGAGCTA 20 59.84 60 Intrón 4 344 6 Reverse GGGCATGGTCCTACAAAGAG 20 59.55 55 Intrón 4 Forward GTTCCAGAACATCCCAGGAA 20 59.90 50 Exón 5 409 7 Reverse CTGTTGTGCAAGAGGTTTCA 20 57.44 45 Intrón 5 Forward AGCCAAACCAAAAATGATCG 20 59.94 40 Intrón 5 367 8 Reverse GTCTGGGTAATCCCCGAAGT 20 60.19 55 Intrón 5 Forward ACGTAACCCTCCTTCCTGCT 20 60.13 55 Intrón 5 433 9 Reverse CCATCTGGCAGTTTCACCTT 20 60.11 50 Intrón 5 Forward TTTTCTCACCAGGCAAAACC 20 60.09 45 Intrón 5 313 10 Reverse AGAGGATGGAAAGGTGCTGA 20 59.80 50 Intrón 5 Forward TAAGGTGGGCAGTACCTTGG 20 59.99 55 Intrón 5 405 11 Reverse GCCACCCAAGAAAACAAGAA 20 60.09 45 Intrón 5 Forward GGAAGTTGGCCACTGTCACT 20 60.16 55 Intrón 5 342 12 Reverse CAACTTTGCAGGACGTCAGA 20 60.02 50 Intrón 5 Forward GCAAAACCTATCCAGCGTGT 20 60.14 50 Intrón 5 484 13 Reverse GTCTGCCAATGAGACTGCAA 20 59.99 50 Intrón 5 Forward CAGTTGATTCCCTTCCCTCA 20 60.04 50 Intrón 5 343 14 Reverse TCCAAAATTGTCCCGAGAAG 20 60.04 45 Intrón 5 Forward TTCTGTGGCGATCATTAGCA 20 60.37 45 Exón 6 338 15 Reverse GCCTTAGGTGGTGAAGTTGG 20 59.59 55 Intrón 6 Forward CCATGGCTGTATCTGTGGTG 20 59.98 55 Intrón 7 473 16 Reverse GGTGGGCAGGGATTAGATTT 20 60.15 50 Intrón 7 Forward CCCAACCTCAAAGGTGAAGA 20 60.08 50 Intrón 7 483 17 Reverse GGAGCAATAAGGTGGGAAAA 20 59.02 45 Intrón 7 Forward TGAAATCCCACCCCTCTAAA 20 59.36 45 Intrón 7 412 18 Reverse TGAGTGACGTCTGCAAGTGG 20 61.09 55 Exón 8 Forward GGTGCATTCCCTCTCTATCG 20 59.65 55 Intrón 8 374 19 Reverse GAGGAAACCCTTCCAAATGC 20 60.81 50 Intrón 8 Forward GTGCAACCTTTCAAGGGAAG 20 59.71 50 Exón 11 333 20 Reverse GCTGTCCTGATGCAAGTTCA 20 59.99 50 Intrón 11 Forward TTAGGGAGGGAGGGTAGTGG 20 60.31 60 Intrón 11 387 21 Reverse TGGTCGCTGTCAAATTACCA 20 60.11 45 Intrón 11 Forward GAGCCCCTTGACATAATCCA 20 59.89 50 Intrón 11 339 22 Reverse TGTCCATGCAGGACTGAAAA 20 60.24 45 Intrón 11 Forward TGATGAACCCAGAAGCAGTG 20 59.83 50 Exón 12 306 23 Reverse TCAAGTCAAGCATCGGATTG 20 59.80 45 Intrón 12 Forward TCACTCTGTTGAACGGCAAA 20 60.43 45 Intrón 12 346 24 Reverse AAACGTGGCTGGTTTTGAAG 20 60.15 45 Exón 13 Forward CTTGAGGGGACTGAATGGAA 20 60.04 50 Intrón 13 371 25 Reverse GGGGAAGGCTGGAGAGATAG 20 60.17 60 Intrón 13 Forward TCTGCTTGCCAACATTGAAG 20 59.99 45 Intrón 13 374 26 Reverse AGGCAGGTCGACACATCTCT 20 59.87 55 Exón 15 Forward TCAGAGTGGGTGTTGGGTAGA 20 60.55 52.38 Intrón 15 300 27 Reverse AATTCTATCTGCCAGCGTCAA 20 59.86 42.86 Intrón 15 Forward TCAGCTGAGATCCTGATGGA 20 59.45 50 Intrón 15 497 28 Reverse CACGCAAGACCACTTCAATG 20 60.30 50 Intrón 15 Forward GATGCAGCACCCAGAGAAAT 20 60.23 50 Intrón 15 433 29 Reverse ACGCCAAGTTTCTCTCCTGA 20 59.99 50 Intrón 15 Forward CTCTGAAGCTGCTCGGAAAC 20 60.28 55 Intrón 15 356 30 Reverse AGGCAGTGATCATCCAGGTC 20 60.08 55 Intrón 15 Forward GCCTGCATTCACCCTTTTAT 20 59.05 45 Intrón 15 431 31 Reverse GAACAAGGGATGGGAAAACA 20 59.77 45 Intrón 15 Forward GAGGCGGTGTACCTGGTAAG 20 59.62 60 Exón 19 328 32 Reverse GTTCTCCGACTGGCTGTCAT 20 60.27 55 Intrón 19 Cuadro 3. Resultado de subproductos de PCR in silico formados por los pares de primers ADAM2-A21 y ADAM2-A22 obtenidos del programa OligoAnalyzer Tool N° de Secuencias Horquillas N° de homodímeros heterodímeros Forward 1 (-0.61/ 34.8° C) 8 17 ADAM2-A21 2 (-0.43/ 30.7° C) Reverse 1 (-1.69/ 41.7° C) 10 Forward 1 (-0.99/ 38.9° C) 11 19 2 (-0.49/ 31° C) 3 (-0.24/ 28° C) ADAM2-A22 4 (-0.17/ 26.5° C) Reverse 1 (-0.05/ 25.9° C) 9 2 (0.21/ 21.7° C) Figura 1. Alineamiento de las secuencias de nucleótidos de ADN y ARNm del gen ADAM2 obtenidas del GenBank con el primer forward ADAM2-A21. Figura 2. Alineamiento de las secuencias de nucleótidos de ADN y ARNm del gen ADAM2 obtenidas del GenBank con el primer reverse ADAM2-A21. Figura 3. Alineamiento de las secuencias de nucleótidos de ADN y ARNm del gen ADAM2 obtenidas del GenBank con el primer forward ADAM2-A22. Figura 4. Alineamiento de las secuencias de nucleótidos de ADN y ARNm del gen ADAM2 obtenidas del GenBank con el primer reverse ADAM2-A22. Figura 5. Amplificación del gen ADAM2-A21. Carril M: marcador de peso molecular de 1 kb; Carril 1-7: amplicones de muestras de alpaca y Carril 8: Control negativo (-). Tamaño de amplicón 328 pb. Figura 6. Amplificación del gen ADAM2-A22. Carril M: marcador de peso molecular de 1 kb; Carril 1-7: amplicones de muestras de alpaca y Carril 8: Control negativo (-). Tamaño de amplicón 497 pb. DISCUSIÓN El gen ADAM2 expresa una proteína denominada de la misma manera, que en su forma madura se encuentra en la superficie de la cabeza de espermatozoides epididimales. Esta proteína cumple la función de mantener la estabilidad estructural de algunos miembros de su familia formando dímeros con ellos y así cumplir un rol importante en la fecundación. Debido a la importancia que representa la expresión de esta proteína en otras especies, se considera necesario su estudio en alpacas, ya que hasta la actualidad no existe mucha información sobre el gen en esta especie, Florentini et al. (2011) realizan un estudio para la detección de transcritos del gen ADAM2 en alpacas, pero no mencionan secuencias de primers para este. Este gen, junto a otros, es considerado de gran importancia para la reproducción, por esto se considera que puede servir como marcador molecular (Bonet et al., 2013). A diferencia de otras investigaciones, en este trabajo se realizó el alineamiento entre las secuencias de ADN y ARNm de ADAM2 de alpaca (NCBI), esto con el fin de identificar las zonas codificantes y no codificantes del gen, para luego determinar cuál es la ubicación de los dos pares de primers seleccionados dentro del genoma de esta especie, de esta manera nos aseguramos de evitar las zonas donde se desconoce el orden de los nucleótidos. El uso de programas bioinformáticos para el diseño de primers permite predecir el tamaño de estos, temperatura melting (Tm), porcentaje de GC, similitud, entre otras características (Dieffenbach et al., 1993). Es por ello, que en diversas investigaciones realizadas en procariotas y eucariotas se emplea el diseño de primers in silico como punto de partida para el trabajo con secuencias genómicas nuevas (genomas bacterianos, genes eucariotas, etc.), lo cual permite disminuir la pérdida de recursos. En la presente investigación se realizó un procedimiento similar al descrito por Thornton y Basu (2010) para el diseño de primers; siendo la diferencia más resaltante que ellos emplearon una secuencia de ARNm y nosotros hemos utilizado la secuencia incompleta del gen ADAM2 en alpaca. Para el diseño de primers se usó el programa bioinformático Primer 3, el cual ha sido empleado en diversas investigaciones en especies procariotas y eucariotas debido a su practicidad, confiabilidad y obtención de secuencias de oligonucleótidos (Aris et al., 2013; Serrano-Martínez et al., 2016; De la Fuente et al., 2018). Se empleó la PCR convencional para la validación de primers por ser una técnica práctica, rápida y económica (Tamay de Dios et al., 2013). Esta metodología se ha utilizado en diversas especies, teniendo como resultado amplicones que coinciden con el tamaño de los productos obtenidos in silico (Pavia et al., 2003; Padilla et al., 2003; Zueter et al., 2018). Existen diversas investigaciones aplicadas a camélidos sudamericanos que han empleado el PCR convencional como su metodología de validación, Arias y Huanca (2009) sexaron embriones de alpaca utilizando la técnica de PCR convencional para amplificar bandas del gen SRY, pero en este caso utilizaron la secuencia molde del gen en guanaco para el diseño de primers, a diferencia de la presente investigación dónde se utilizaron secuencias específicas de alpaca, lo cual genera resultados más confiables al tratarse de primers específicos para la especie, pero no en todos los casos es posible encontrar las secuencias necesarias para el objeto de estudio. Al igual que Montes et al. (2009) que emplearon la técnica de PCR para obtener amplicones gen TLR2 en alpacas, considerando validados aquellos primers cuyos amplicones obtenidos empleando PCR convencional y visualizados en gel agarosa coinciden en tamaño de pares de bases con lo diseñado in silico. En este trabajo se validaron al comparar el tamaño de los amplicones obtenidos con los resultados del programa Primer 3, siendo el caso de ADAM2-A21 y ADAM2-A22 cuyos tamaños serían 328 y 597 pb respectivamente (Figuras 5 y 6). Hasta la actualidad no existe mucha información sobre el gen ADAM2 en alpacas mientras que, en otras especies, como por ejemplo en porcinos y bovinos, ya es conocido como un candidato para el mejoramiento genético en el ámbito reproductivo (Bonet et al., 2012; Mishra et al. 2013), es por esto importante continuar los estudios en este gen para que en un futuro sea utilizado como un marcador molecular. CONCLUSIONES Se puede concluir mediante este estudio que es posible el diseño y validación de primers para el gen ADAM2 en alpacas in silico, logrando ser validados empleando la técnica de PCR convencional. Los primers diseñados en este trabajo se pueden utilizar en un futuro para identificar marcadores moleculares para la selección temprana de machos reproductores de alpaca. AGRADECIMIENTOS Este trabajo fue cofinanciado por el Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica (CONCYTEC) y la Universidad Científica del Sur, a través del proyecto <>, contrato N.º 118-2016-FONDECYT. LITERATURA CITADA 1. Arias N, Huanca W. 2009. Un método para el sexaje por ADN de alpaca amplificando el gen SRY mediante PCR. Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú 20:203-207. doi: 10.15381/rivep.v20i2.607 2. Aris M, Sukenda, Harris E, Sukadi M, Yuhana M. 2013. Molecular identification of pathogenic bacteria and PCR specific primer design. Budidaya Perairan 1: 4-50. doi: 10.35800/bdp.1.3.2013.2733 3. Banda J, Evangelista S, Ruiz L, Sandoval R, Rodríguez C, Valdivia M et al. 2010. 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