Facultad de Ciencias Veterinarias y Biológicas Carrera de Medicina Veterinaria y Zootecnia “EFECTO DE UN ADITIVO FITOGÉNICO SOBRE EL DESEMPEÑO PRODUCTIVO E INTEGRIDAD INTESTINAL EN POLLOS DE ENGORDE DESAFIADOS CON Clostridium perfringens” Tesis para optar el Título Profesional de: MÉDICO VETERINARIO Y ZOOTECNISTA Presentado por: Bach. Daniela Elvira Inés Fernández Salazar Asesora: Dra. Connie Gallardo Vela Lima – Perú 2020 Efecto de un aditivo fitogénico sobre el desempeño productivo e integridad intestinal en pollos de engorde desafiados con Clostridium perfringens D. Fernández Salazar, C. Gallardo Vela* Carrera de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Científica del Sur, Km. 19 de la Panamericana Sur, Lima 32, Perú *Autor correspondiente. Tel: +51 1 610-6400 anexo 1355. E-mail: cgallardov@cientifica.edu.pe Pollos de engorde desafiados con Clostridium perfringens Resumen Desde la restricción de antibióticos como promotores de crecimiento en la alimentación animal, la industria se encuentra en búsqueda de alternativas de origen natural que puedan reemplazar su uso. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de un aditivo fitogénico sobre el desempeño productivo e integridad intestinal en pollos de engorde desafiados con Clostridium perfringens. Se utilizaron 448 pollos de engorde machos (Cobb 500) de 1 a 42 días de edad, los cuales se distribuyeron a través de un diseño completamente al azar en cuatro tratamientos experimentales, con siete repeticiones de 16 pollos cada una. Los tratamientos planteados fueron: aves sin fitogénico y sin desafío con C. perfringens (T1: Control Negativo); aves sin fitogénico y con desafío con C. perfringens (T2: Control Positivo); aves con fitogénico en dosis preventiva desde el día 1 al 42 de edad y con desafío con C. perfringens (Tratamiento T3); y aves con desafío a C. perfringens y con fitogénico en dosis de tratamiento por 5 días al observarse signos clínicos de la enfermedad (Tratamiento T4). Todas las aves, excepto las del Control Negativo, fueron desafiadas por tres días consecutivos con C. perfringens en el agua de bebida, en los días 19, 20 y 21 de la investigación. Se evaluó el desempeño productivo, la histología intestinal y la cuantificación de UFC/g de Clostridium perfringens en duodeno y ciegos. Tras el desafío con Clostridium perfringens, se observó un notable descenso de los parámetros productivos en el Control Positivo. Además, en este, la longitud de las vellosidades intestinales fue menor (p < 0.05) a los 2 y 8 días post infección con C. perfringens. En contraste, en el tratamiento T3, el fitogénico afectó significativamente (p < 0.05) el peso de las aves, mejorando la ganancia de peso, el consumo de alimento y el índice de conversión, mejorándolos. Tras el desafío con C. perfringens, las aves del T4, las cuales recibieron el aditivo fitogénico en agua de bebida, mejoraron la ganancia de peso diaria. El fitogénico permitió que exista un menor recuento de UFC/g en duodeno y ciego (p < 0.05) tras la infección. Por tanto, el uso de un aditivo fitogénico puede mejorar el desempeño productivo, la integridad intestinal y el recuento de C. perfringens en pollos de engorde desafiados con C. perfringens. Palabras claves: fitogénico, peso, pollos de engorde, vellosidad intestinal 1. Introducción La industria avícola constituye una de las principales actividades económicas de los países latinoamericanos. Uno de los mayores desafíos de la producción son las enfermedades entéricas de origen bacteriano, ya que aumentan la morbilidad y la mortalidad en las aves, así como la contaminación de productos derivados para consumo humano. Por ello, resulta necesario aplicar programas adecuados de sanidad y nutrición en las granjas. Una práctica usual fue el uso de antibióticos como promotores de crecimiento. Sin embargo, la restricción mundial de estos en la nutrición animal está en aumento, desde que la Comisión Europea, en el 2006 (Reglamento CE nº 1831/2 003; Huyghebaert et al., 2011), prohibe el uso de antibióticos que puedan afectar la salud de animales de consumo humano. Esto generó el interés de utilizar alternativas que garanticen el máximo crecimiento de los animales, sin afectar la inocuidad del producto final. Bacterias patógenas como Salmonella sp., algunas E. coli, Clostridium perfringens, Clostridium colinum y Campylobacter spp. poseen serogrupos que producen enterotoxinas capaces de adherirse al epitelio intestinal y causar cambios en el flujo de agua y electrolitos en el intestino delgado, lo que conduce a la lisis y la muerte celular, causando pérdida de agua y diarreas (Bjerrum et al., 2005; Huyghebaert et al., 2011). Por lo tanto, el mantenimiento de la salud intestinal, al permitir que el organismo obtenga la energía y los nutrientes adecuados, es fundamental para la optimización de la expresión genética de las aves y, en consecuencia, el mejor rendimiento productivo. Craven et al. (2003) enfatizan la importancia de establecer criterios de manejo que mantengan la integridad funcional de los diferentes tipos de células que componen y caracterizan los órganos del tracto digestivo y sus glándulas anexas, así como el control de enfermedades entéricas que reduzcan la efectividad del proceso digestivo. La enteritis necrótica es una de las enfermedades entéricas de mayor importancia económica en la avicultura, pues afecta el rendimiento productivo, aumenta la conversión de alimento y reduce la ganancia de peso (Van Der Sluis, 2000). Es causada por Clostridium perfringens, una bacteria anaerobia oportunista y grampositiva, que en condiciones normales se encuentra en pequeñas cantidades en el intestino delgado debido al pH ácido y la alta concentración de CO2, pero también puede ser una de las primeras bacterias en colonizar el ciego del pollo (Adams, 2006). Cuando en el intestino, se establecen cepas patógenas de C. perfringens en niveles significativos, se puede evidenciar necrosis intestinal, hemorragia y diarrea; la mortalidad aumenta en aves más severamente afectadas (Bortoluzzi, 2019). Hofacre (1998) clasificó las lesiones macroscópicas en el intestino según su magnitud, donde 0 = ninguno, 1 = leve, 2 = moderado y 3 = marcado. En el caso de la enteritis causada por Clostridium, en una lesión de grado 3, se observa necrosis, desprendimiento de la mucosa intestinal y contenido sanguinolento. Diferentes investigaciones en pollos de engorde frente a C. perfringens (Díaz Carrasco, 2016) han mostrado que el uso de productos de origen vegetal puede ser una alternativa para promover el equilibrio en la microbiota intestinal de pollos. Estos aditivos se denominan fitogénicos y son sustancias, derivadas de plantas, que tienen principios activos capaces de actuar inhibiendo el crecimiento de microorganismos patógenos en el intestino (Applegate et al., 2010), mejorando la digestibilidad y aprovechamiento de los nutrientes y estimulando la secreción de moco intestinal (Jamroz et al., 2006). El principal componente de los fitogénicos son los polifenoles; su composición y concentración puede variar dependiendo de la parte de la planta utilizada, temporada de cosecha, origen geográfico y técnica de procesamiento (Peralta et al., 2018; Windisch et al., 2008). Sin embargo, en comparación con los antibióticos sintéticos, los fitogénicos son compuestos naturales, de baja toxicidad y libres de residuos en los productos derivados (Hashemi y Davoodi, 2010). Así, el objetivo de la investigación fue determinar el efecto de la suplementación con un aditivo fitogénico sobre el desempeño productivo e integridad intestinal en pollos de engorde desafiados con C. perfringens. Para el estudio, se utilizó un bactericida comercial de origen vegetal (Alquermold Natural de BIOVET S.A. – Cataluña, España), a base de tomillo y ácido cítrico (E-330). 2. Materiales y métodos El estudio se realizó en la Unidad Avícola Experimental de una granja comercial ubicada en Villa El Salvador, Lima, Perú. La metodología empleada y los procedimientos de investigación fueron aprobados por el Comité Institucional de Ética en Experimentación con Animales y Biodiversidad de la Universidad Científica del Sur (código de registro 218-2018-PRE16) y se siguieron las recomendaciones de acuerdo con los principios de bienestar animal. A las instalaciones utilizadas en este ensayo, se les aplicó un programa sanitario integral de limpieza, desinfección y fumigación. Animales, diseño experimental y dietas Para el estudio, se utilizó un total de 448 pollos de engorde machos (Cobb 500) de un día de edad, que fueron vacunados en la incubadora contra la Enfermedad de Newcastle (NC), Bronquitis Infecciosa Aviar (BI) y la Enfermedad de Gumboro (IBD). Todas las aves recibieron un programa de vacunación recomendado para la zona. La alimentación, el manejo y las condiciones ambientales se mantuvieron similares, siguiendo los protocolos que normalmente se emplean bajo condiciones de granja. Las aves fueron distribuidas en un Diseño Completamente al Azar en cuatro tratamientos experimentales, con siete repeticiones de 16 pollos cada una. Los tratamientos utilizados fueron: Tratamiento 1 (Control Negativo) – sin fitogénico y sin desafío con C. perfringens; Tratamiento 2 (Control Positivo) – sin fitogénico y con desafío con C. perfringens, Tratamiento 3 (con aditivo fitogénico como preventivo) – con fitogénico en dosis preventiva desde el día 1 al 42 del experimento (0.5 kg/t de alimento) y con desafío con C. perfringens; Tratamiento 4 (con aditivo fitogénico como tratamiento) – con desafío a C. perfringens y con fitogénico en dosis de tratamiento (1 g/L de agua) por 5 días al observarse signos clínicos de la enfermedad. Para la investigación, se elaboró una dieta basal (Tabla 1) para pollos de carne en tres fases nutricionales diferenciadas: inicio (1 a 21 días), crecimiento (22 a 35 días) y acabado (36 a 42 días). La elaboración de las fórmulas se hizo tomando como referencia los requerimientos energéticos y nutricionales de la línea genética de los pollos de engorde (Cobb 500, 2017), y las recomendaciones de Rostagno et al. (2017). Las dietas administradas fueron en forma de harina. Para todas las fases de producción, se incluyó un secuestrante de micotoxinas. Todas las dietas fueron isocalóricas e isoproteicas (Tabla 1), y estuvieron libres de APC. Tanto el alimento como el agua de bebida fueron administrados ad libitum. Tras el desafío con C. perfringens, el manejo diario de las aves infectadas se realizó exclusivamente por un personal que no tuvo acceso a las aves del Control Negativo, para evitar una posible contaminación cruzada dentro de la Unidad Experimental. Aditivo fitogénico Para el estudio, se utilizó un bactericida comercial de origen vegetal (Alquermold Natural de BIOVET S.A. – Cataluña, España), a base de Thymus vulgaris (anillo cimenol proveniente del tomillo) y ácido cítrico (E-330). Tabla 1. Composición centesimal y nutricional de las dietas experimentales* utilizadas en los pollos de engorde del ensayo realizado en Lima-Perú, 2017. Inicio Crecimiento Acabado 1 a 14 d 14 a 28 d 28 a 42 d INGREDIENTES (%) % % % Maíz amarillo 57.539 62.543 64.396 Torta de soya 34.778 29.625 27.303 Aceite de soya 3.745 4.103 4.937 Fosfato dicálcico 1.752 1.640 1.440 Carbonato de calcio 0.942 0.891 0.824 Sal común 0.414 0.414 0.415 DL-Metionina 0.273 0.238 0.199 Lisina HCl 0.155 0.153 0.100 Premix vit. y minerales1 0.120 0.120 0.120 Cloruro de colina, 60 0.100 0.100 0.100 Treonina 0.057 0.048 0.041 Antioxidante 0.025 0.025 0.025 Secuestrante 0.050 0.050 0.050 Aditivo fitogénico o caulin2 0.050 0.050 0.050 Contenido nutricional analizada3 Energía metabolizable, kcal/kg 3008 3086 3157 Proteína total, % 21.5 19.5 18.5 Fibra total, % 3.40 3.46 3.49 Calcio, % 0.90 0.84 0.76 Fósforo disponible, % 0.45 0.42 0.38 Sodio, % 0.18 0.18 0.18 *Tratamientos: T1: Control Negativo; T2: Control Positivo; T3: Tratamiento 3, aves con fitogénico en dosis preventiva desde el día 1 al 42 de edad; T4: Tratamiento 4, aves con fitogénico en dosis de tratamiento tras observarse signos clínicos de la enfermedad. 1Premix vitamina y minerales: Ácido fólico 100 0000 mg/kg, Ac. Pantoténico 1620 mg/kg, Biotina 6100 mg/kg, Cobre 1220 0000 mg/kg, Colina 60 g/kg, Hierro 10.2 g/kg, Yodo 243 mg/kg, Mn 12.6 g/kg, Niacina 5000 mg/kg, Selenio 70 mg/kg, Vit. A 1.290,000 ui/kg, Vit. B1 410000 mg/kg, Vit. B12 1.730,00 mcg/kg, Vit. B2 800 mg/kg, Vit. B6 400,000 mg/kg, Vit. D3 350.000,00 UI/kg, Vit E 2.500 mg/kg, Vit. K 300,000 mg/kg, Zinc 12630 g/kg. 2Tratamientos: T1, T2 y T4 se adicionó caulin a 0.5 kg/t de alimento para equilibrar la dieta. El caulin es una arcilla blanca inerte que no es absorbida por los animales y no altera la composición. Solo al Tratamiento 3 (T3), adicionalmente sobre la dieta basal, se agregó el fitogénico en dosis 0.5 kg/t de alimento, desde el día 1 al 42. 3Dietas analizadas en base a materia seca en el Laboratorio de Evaluación Nutricional de Alimentos. Universidad Nacional Agraria La Molina. Clostridium perfringens y desafío sanitario Para el desafío, se obtuvo una cepa de C. perfringens tipo A, proveniente del Laboratorio de Patología Aviar de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, la cual fue aislada de aves positivas a C. perfringens y genotipificadas mediante PCR múltiple. El desafío sanitario con C. perfringens se realizó en el agua de bebida por tres días consecutivos, en los días 19, 20 y 21 de la investigación. Todas las aves fueron desafiadas, excepto las del Control Negativo. Cada día, el cultivo de C. perfringens se disolvió en el agua a dosis de 1 x 108 UFC/ml y se administró vía oral en los bebederos manuales dispuestos. Previo a ello, se retiró el alimento y el agua, 4 y 2 horas antes del desafío, respectivamente, con la finalidad de garantizar que todos los pollos consuman el agua con C. perfringens. Las aves consumieron toda el agua en un lapso de 30 minutos. Terminado ese tiempo, se les brindó alimento y agua sin C. perfringens. Desempeño productivo A los 7, 14, 21, 35 y 42 días de edad, las aves y el alimento sobrante fueron pesados para determinar el peso corporal promedio, la ganancia de peso corporal, el consumo de alimento, el Índice de Conversión Alimenticia y la uniformidad. La mortalidad fue registrada diariamente y evaluada cada semana. Histopatología intestinal Para la histopatología, un ave de cada repetición fue seleccionada y sacrificada manualmente a los 18, 23 y 29 días de edad, correspondiendo su evaluación a un día antes del primer desafío, 2 y 8 días después del último desafío, respectivamente. Las aves fueron sacrificadas por dislocamiento cervical, y todo el intestino fue expuesto para la toma de muestras. Se colectó segmentos del tracto intestinal a nivel de duodeno, yeyuno, íleon, colon y ciego, siendo en total cinco muestras por ave. Se tomaron porciones más o menos cuadradas de entre 0.5 y 0.7 cm de espesor para favorecer la penetración del fijador hasta las zonas centrales. Se procuró extraer tejido lesionado abarcando parte de tejido normal. Los cortes se hicieron en la región media de duodeno y yeyuno, en íleon cerca a los ciegos y en colon y ciego a un mismo nivel. El proceso desde el sacrificio hasta la colecta de las muestras no sobrepasó los 10 minutos. Inmediatamente tras la colecta, los tejidos fueron depositados en recipientes de plástico con cierre hermético, donde se fijaron por inmersión en formol tamponado y diluido al 10%. Tras las 24 horas, se realizó la reducción para la posterior preparación de la lámina histológica. Se observaron las lesiones al microscopio y posteriormente se realizó la medición de la longitud de cada segmento, analizando altura de vellosidades y profundidad de criptas 10 veces en un campo de 250 μm con un objetivo 10X; luego, se calculó el promedio de las lecturas. Para la altura de las vellosidades, la medición fue desde la región basal, que coincide con la porción superior de las criptas, hasta el vértice; en contraste, las mediciones de la profundidad de las criptas se realizaron desde la base de la región de transición cripta-vellosidad. Cuantificación de colonias de Clostridium perfringens en duodeno y ciegos Para los análisis microbiológicos, un ave de cada repetición fue seleccionada y sacrificada manualmente a los 18, 23 y 29 días de edad, evaluando antes del primer desafío, 2 y 8 días después del último desafío, respectivamente. Se seleccionaron dos porciones del intestino por ave, correspondientes al duodeno y ciego. Se realizó un corte de 4 a 5 cm, con 1 a 2 g de contenido, para realizar las diluciones posteriores. Se trabajó en una placa Petri un machacado de la muestra en solución salina a fin de extraer todos los posibles agentes que pudieran encontrarse ese nivel del intestino. Luego, se filtró con una solución salina bufferada en doble o triple gasa a través de un embudo, y se separó el tejido que forma parte del intestino de los agentes que contenga. Se reservó ese filtrado y se realizaron tres diluciones para establecer un posterior recuento: 1 en 10 ml, 1 en 100 ml, 1 en 1000 ml. El filtrado fue sembrado por incorporación al agar SPS, el cual es un medio de cultivo selectivo para el aislamiento de Clostridium. La incorporación consistió en colocar un volumen del filtrado en una placa Petri y agregar 8 ml del agar licuado atemperado (35°C); se homogenizó lentamente y se dejó reposar por 3 minutos. Luego, se agregó una segunda capa de agar y se dejó solidificar. Las placas fueron dispuestas en jarras de anaerobiosis con capacidad aproximada para 10 placas, se incorporó un Anaerocult de Merck hidratado (comercial) con agua destilada y se cerró inmediatamente. Las jarras se colocaron dentro de la incubadora, a 35°C +/- 2°C por 48 horas. Posteriormente, se realizó el recuento de UFC. Al abrir las jarras, se evidenció, en el medio ámbar, el crecimiento de colonias positivas a Clostridium por el precipitado negro producido por la reducción de sulfitos. Por muestra, se seleccionaron 5 colonias presuntivas para C. perfringens para las pruebas bioquímicas. Para ello, las colonias se sembraron en un medio de Nitrato-movilidad por 24 horas y Agar gelatina por 48 horas. Se identificó el C. perfringens por ser inmóvil y por su capacidad de hidrólisis. Con base a los resultados, se calculó la proporción en porcentaje de C. perfringens del recuento inicial de Clostridium, lo cual se extrapoló. El resultado negativo se expresó como < 10, pues el método detecta un mínimo de 10 bacterias. Análisis estadístico Los datos fueron procesados siguiendo el procedimiento GLM del programa estadístico SAS (versión 9.2). Se realizó la prueba de normalidad de los datos (Shapiro-Wilk) y el Análisis de Varianza (ANVA). Posteriormente, al encontrarse significancia del efecto de los tratamientos, se realizó la prueba de comparación de medias de Tukey, considerando un nivel de significancia de 5%. Los datos que no siguieron una distribución normal fueron transformados a valores arcoseno para su análisis. 3. Resultados y discusión Desempeño productivo En la Tabla 2, se observan los resultados del desempeño productivo de los pollos de engorde con y sin desafío con C. perfringens a los 42 días de edad. Hubo efectos significativos (p < 0.05) en los tratamientos experimentales sobre la ganancia de peso, consumo de alimento, índice de conversión alimenticia, uniformidad y mortalidad. El grupo de aves del T3 presentó mayor ganancia de peso y consumo de alimento, así como mejor I.C.A., en comparación con las aves del T2 (Control Positivo). Entre el Control Negativo (T1) y el T3, no hubo diferencias significativas (p > 0.05) en ganancia de peso, consumo de alimento, I.C.A. o mortalidad, lo cual indica que la adición del fitogénico en dosis preventiva mitigó los efectos del desafío con Clostridium sobre el desempeño productivo. El T2 presentó menor uniformidad y mayor mortalidad que los otros tratamientos. El T4, que recibió el fitogénico en agua de bebida tras la observación de signos clínicos, aumentó el consumo de alimento y mejoró la ganancia de peso diaria, en comparación con el Control Positivo; asimismo, logró un menor I.C.A. y redujo la mortalidad. El tratamiento y prevención con el fitogénico (T3 y T4) permitió la recuperación de la uniformidad de los animales. Así, las propiedades del aditivo fitogénico utilizado, el cual estaba formado por tomillo y ácido cítrico, pudieron contribuir al mejor desempeño productivo después del desafío con C. perfringens en las aves que lo recibieron como preventivo desde el primer día de edad. Estos resultados demostrarían que los extractos vegetales del tomillo y del ácido cítrico fueron más eficaces en combinación sobre la absorción de los nutrientes, ya que el anillo de cimenol del tomillo actuaría sinérgicamente con el ácido cítrico (Tesouro y Latasa, 2017), mejorando su efecto acidificante en el intestino. Estos resultados concuerdan con los hallazgos de Feizi et al. (2013), quienes indicaron que el tomillo tiene un efecto positivo sobre la salud intestinal, al tener propiedades antibacterianas y antiinflamatorias, lo que favorece el aprovechamiento de los nutrientes, llevando a que las aves tengan mayor ganancia de peso y menor conversión alimenticia. Por otra parte, Cross et al. (2011) evaluó la inclusión del extracto de tomillo de manera individual y combinada con otros extractos naturales en dietas para pollos de engorde de 1 a 42 días de edad, no encontrando efectos significativos del uso del tomillo de manera independiente de otros extractos, pero sí hubo efectos significativos al combinarlo con otros extractos vegetales. Los autores atribuyeron esta respuesta a la sinergia que puede existir entre diferentes extractos, lo que potencializaría su acción en la digestibilidad de los nutrientes. Viola y Vieira (2007) sostienen que los ácidos orgánicos de cadena corta como el ácido cítrico promueven el aumento en el tamaño de las vellosidades intestinales por la proliferación celular en las criptas, y con ello, el incremento de su área de absorción. Por otro lado, el uso de acidificantes en la dieta de los pollos de engorde promovería la salud intestinal, al favorecer el crecimiento de bacterias benéficas en los diferentes segmentos del intestino, fortaleciendo la microbiota intestinal, lo cual podría contribuir a una mayor absorción de nutrientes, al incrementar la hidrólisis de las proteínas en el tracto intestinal (Dhama et al., 2015). Así, es posible que se haya producido un efecto sinérgico entre el tomillo y el ácido cítrico, favoreciendo su actividad, aumentando la funcionalidad del intestino y los órganos digestivos para la absorción de nutrientes, y mejorando el desempeño productivo en las aves que recibieron el fitogénico desde el día 1 de edad. Tabla 2. Promedios de desempeño productivo en pollos de engorde con y sin desafío con Clostridium perfringens del ensayo realizado en Lima-Perú, 2017. Tratamientos1 Promedios T1 T2 T3 T4 EPM2 P-Valor Peso inicial (g) 45.86 46.14 45.71 45.29 0.3072 0.203 Peso final (g) 3343.9a 3062.89c 3355.55a 3201.79b 89.343 0.033 Ganancia de peso (g) 3298.04a 3016.75c 3309.84a 3156.50b 94.437 0.014 Consumo de alimento (g) 5639.65a 5460.32b 5726.02a 5555.44b 98.57 <0.001 I.C.A (g/g)3 1.71c 1.81a 1.73c 1.76b 0.0356 0.042 Uniformidad (%) 80.14b 74.14c 86.14a 81.76b 3.30 <0.001 Mortalidad (%) 2.27a 9.09c 3.41a 4.55b 1.59 <0.001 1 Tratamientos: T1: Control Negativo; T2: Control Positivo; T3: Tratamiento 3, aves con fitogénico en dosis preventiva desde el día 1 al 42 de edad; T4: Tratamiento 4, aves con fitogénico en dosis de tratamiento tras observarse signos clínicos de la enfermedad. 2 EPM: Error Padrón de la Media 3 I.C.A: Índice de Conversión Alimenticia abc Letras diferentes como superíndice indican diferencias estadísticamente significativas en la prueba de comparación de medias de Tukey, con un nivel de significancia de 5%. Histología intestinal En la Tabla 3, se observan los resultados de la longitud de las vellosidades intestinales y la profundidad de las criptas de Lieberkühn. A partir del desafío con Clostridium, se observa efectos significativos (p < 0.05) en los tratamientos, a nivel de duodeno, yeyuno, íleon y ciego, mas no en colon. En las dos evaluaciones después de concluida la administración del inóculo, el Control Positivo (T2) presentó menor longitud de vellosidades intestinales y mayor profundidad de criptas. El Control Negativo (T1) y el T3 presentaron vellosidades intestinales con mayor altura y criptas con menor profundidad. En las aves del T4, se observan valores intermedios. Estos resultados evidencian que el desafío con Clostridium perfringens afectó la estructura del intestino y redujo la superficie de absorción; por tanto, la capacidad de asimilación de nutrientes fue restringida. Porter (1998) indicó que el mayor daño producido por la presencia de Clostridium ocurre en la mucosa del yeyuno e íleon. En la última evaluación, el segmento más afectado fue el íleon, seguido de duodeno y yeyuno; a pesar de esto, en las aves del T3, se evidencia la conservación de la longitud de las vellosidades intestinales y una menor profundidad de criptas en dicha sección, estadísticamente comparable con el Control Negativo (p < 0.05), lo cual muestra que el fitogénico preservó el desarrollo de las vellosidades, conllevando a una mayor capacidad de digestión y absorción de nutrientes (Fernández-Rubio et al., 2009), lo que finalmente se tradujo en una mayor ganancia de peso. Para que el crecimiento de las aves se desarrolle adecuadamente, debe haber un equilibrio dinámico entre la mucosa intestinal y el contenido luminal; además, las características estructurales y funcionales de la mucosa se deben conservar dentro del patrón esperado (Hashemi y Davoodi, 2011). Por lo tanto, el mantenimiento de la integridad intestinal es esencial para los procesos eficientes de digestión y absorción, y se deben establecer criterios de gestión para mantener el control de los patógenos entéricos que puedan reducir la efectividad del proceso digestivo (Huyghebaert et al., 2011). Tabla 3. Promedios de longitud de vellosidades intestinales y profundidad de criptas de Lieberkühn en duodeno, yeyuno, íleon y ciego de pollos de engorde con y sin desafío de Clostridium perfringens del ensayo realizado en Lima-Perú, 2017. Preinfección 2 días post-infección 8 días post-infección Tratamientos (18 d de edad) (23 d de edad) (29 d de edad) **PCL **PCL *LVI (mm) *LVI (mm) *LVI (mm) **PCL (mm) (mm) (mm) Duodeno T1 1171 171 1171 158bc 1186a 171 T2 1176 172 1114 207a 986b 193 T3 1187 171 1157 143c 1186a 170 T4 1171 172 1143 171b 1157ab 186 EPM 10.26 5.5 11.09 13.68 73.26 21.11 P-Valor 0.234 0.152 0.079 0.047 0.003 0.087 Yeyuno T1 1157 175 1143a 107c 1143ab 157 T2 1143 174 900b 200a 914c 243 T3 1134 179 1143a 129c 1171a 165 T4 1157 176 1114a 171b 1014b 184 EPM 9.78 1.87 71.73 19.68 73.25 18.79 P-Valor 0.109 0.233 0.049 0.001 0.026 0.057 Íleon T1 1073 177 1057 157 1100a 100b T2 1071 177 1043 171 771c 157a T3 1071 176 1057 107 1057a 114b T4 1072 174 1043 129 957b 152a EPM 0.83 1.22 7 16.78 86.72 14.25 P-Valor 0.245 0.301 0.175 0.097 0.006 0.041 Ciego T1 643 93 586a 60b 593 80 T2 600 93 370c 100a 433 100 T3 614 93 543a 93a 586 82 T4 629 94 464b 100a 500 89 EPM 16.1 0.43 42.13 6.56 32.3 7.70 P-Valor 0.268 0.343 0.002 0.014 0.078 0.104 Colon T1 500 99 500 100 529 100 T2 521 98 517 92 408 103 T3 543 98 536 100 575 100 T4 521 96 521 100 529 100 EPM 15.2 1.09 13.82 3.46 32.29 1.30 P-Valor 0.311 99 0.235 100 0.092 100 1Tratamientos: T1: Control Negativo; T2: Control Positivo; T3: Tratamiento 3, aves con fitogénico en dosis preventiva desde el día 1 al 42 de edad; T4: Tratamiento 4, aves con fitogénico en dosis de tratamiento tras observarse signos clínicos de la enfermedad. 2EPM: Error Padrón de la Media abc Letras diferentes como superíndice indican diferencias estadísticamente significativas en la prueba de comparación de medias de Tukey, con un nivel de significancia de 5%. *LVI: longitud de vellosidad intestinal en duodeno, yeyuno e íleo y longitud de microvellosidad intestinal a nivel de colon y ciegos. **PCI: Profundidad de criptas intestinales de Lieberkühn. Cuantificación de colonias de Clostridium perfringens en duodeno y ciegos En la Tabla 4, se observa el efecto de los tratamientos sobre la cantidad de UFC/g de Clostridium a nivel de duodeno y ciegos. Tras el desafío, hubo diferencias significativas entre los tratamientos sobre la presencia de sulfito-reductores. A los 2 y 8 días post-infección, en el duodeno, se evidenció valores menores a 10 UFC/g de Clostridium perfringens (p > 0.05); mientras que, a nivel de los ciegos, la cantidad de UFC/g fue significativamente superior en los tratamientos T2 y T4 (p < 0.05) y en mayor medida, en el recuento general de Clostridium sulfito-reductores. Esto coincide con Adams (2006), que señala que Clostridium puede colonizar rápidamente el ciego del pollo. En las aves del T3, el fitogénico en dosis preventiva mantuvo valores bajos de UFC/g en los ciegos tras el desafío; y en el duodeno, presentó cantidades menores a las del Control Positivo. Cross et al. (2011) no encontraron efectos significativos del tomillo sobre la carga bacteriana; sin embargo, notaron una reducción numérica de Salmonella y Clostridium perfringens, en comparación con las aves del grupo control. Khan et al. (2012) indicaron que el uso del tomillo como aditivo en la dieta de aves puede disminuir la carga de bacterias patógenas en el intestino, especialmente a nivel del intestino delgado, al tener acción antibacteriana, la cual se ve potencializada al promover la leucopoyesis, elevando los trombocitos de la sangre. En esta investigación, no se observó presencia de Clostridium perfringens mayor a 10 UFC/g en duodeno. Así, las cantidades encontradas corresponderían a la cantidad normal de la microbiota intestinal. Estudios reportados por Si et al. (2007) manifestaron que la proliferación de Clostridium perfringens a nivel intestinal está asociada a factores de estrés y presencia de coccidias, siendo necesario que se presenten ambas condiciones para que exista la proliferación de Clostridium perfringens en el intestino. Adicionalmente, para evaluar la enteritis necrótica en condiciones experimentales, se pudo individualizar la administración del inóculo, aplicándolo directamente al buche de cada ave. Cabe mencionar que, en condiciones de campo, no se determina si existen estos factores estresantes antes de aplicar vacunas contra C. perfringens, posiblemente incurriendo en gastos de vacunación sin ser estos necesarios. Tabla 4. Promedios de Clostridium sulfito-reductores y cantidad de Clostridium perfringens a nivel de duodeno y ciego en pollos de engorde con y sin desafío de Clostridium perfringens del ensayo realizado en Lima-Perú, 2017. Preinfección 2 días post-infección 8 días post-infección (18 d de edad) (23 d de edad) (29 d de edad) Tratamientos Número Número Clostridium Clostridium Número Clostridium Clostridium Clostridium Sulf. Red. Sulf. Red. Clostridium Sulf. Red. perfringens perfringens UFC/g UFC/g perfringens UFC/g UFC/g UFC/g UFC/g Duodeno T1 540 < 10 589b < 10 567d < 10 T2 538 < 10 780a < 10 7000a < 10 T3 562 < 10 765a < 10 2340c < 10 T4 547 < 10 782a < 10 5000b < 10 EPM 8.14 ---- 31.22 ---- 356.31 ---- P-Valor 0.127 ---- 0.007 ---- <0.001 ---- Ciegos T1 487 < 10 240c < 10c 650c < 10c T2 491 < 10 3000a 400a 4000a 200a T3 478 < 10 345c < 10c 980c < 10c T4 473 < 10 1800b 90b 2800b 90b EPM 7.34 ---- 357.81 84.56 346.32 42.46 P-Valor 0.206 ---- <0.001 0.013 <0.001 0.006 1Tratamientos: T1: Control Negativo; T2: Control Positivo; T3: Tratamiento 3, aves con fitogénico en dosis preventiva desde el día 1 al 42 de edad; T4: Tratamiento 4, aves con fitogénico en dosis de tratamiento tras observarse signos clínicos de la enfermedad. 2EPM: Error Padrón de la Media abc Letras diferentes como superíndice indican diferencias estadísticamente significativas en la prueba de comparación de medias de Tukey, con un nivel de significancia de 5%. 4. Conclusión El tratamiento con el fitogénico mejoró la ganancia de peso, el consumo de alimento, la conversión alimenticia y la uniformidad, y disminuyó la mortalidad. El crecimiento de las vellosidades intestinales promovió una mayor absorción de nutrientes, lo que mejoró el desempeño productivo. El uso de un fitogénico a base de tomillo y ácido cítrico usado como preventivo en la dieta puede ser una estrategia eficiente para mejorar los parámetros productivos y la longitud de las vellosidades intestinales en duodeno, yeyuno e íleon en aves desafiadas con Clostridium perfringens. Bibliografía Adams, C. A. Nutrition-based health in animal production. (2006). Nutrition Research Reviews, 19(1), 79–89. Applegate, T.J., Klose, V., Steiner, T., Ganner, A., & Schatzmayr, G. (2010). Probiotics and phytogenics for poultry: myth or reality? Journal of Applied Poultry Research, 19(2), 194–210. https://doi.org/10.3382/japr.2010-00168 Bjerrum, L., Pedersen, K., & Engberg, R. M. (2005). 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