FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y BIOLÓGICAS CARRERA PROFESIONAL DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA “PREVALENCIA DE ANTICUERPOS CONTRA CHLAMYDOPHILIA ABORTUS EN BOVINOS DE CRIANZA EXTENSIVA DE LOS DISTRITOS DE CORACORA, CHUMPI, Y PULLO DE LA PROVINCIA DE PARINACOCHAS, AYACUCHO – 2018” TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO DE: MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA NOMBRE DEL TÍTULO A OBTENER PRESENTADO POR: JEAN PIERRE LOLI PIN ASESOR: ASESOR: SIEVER MIGUEL MORALES-CAUTI1 LIMA – PERÚ 2020 Prevalencia de anticuerpos contra Chlamydophilia abortus en bovinos de crianza extensiva de los distritos de Coracora, Chumpi, y Pullo de la provincia de Parinacochas, Ayacucho - 2018 Jean Pierre Loli Pin1; Eglinton Villacaqui A1; Siever Morales-Cauti1,2 1Carrera de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Científica del Sur, Lima, Perú. 2Email: sieverm@hotmail.com RESUMEN El objetivo del presente estudio fue determinar la prevalencia de anticuerpos contra Chlamydophila abortus en el ganado bovino de los distritos de Coracora, Chumpi y Pullo de la provincia de Parinacochas, departamento de Ayacucho durante el 2018 donde los bovinos son criados de forma extensiva y con reproducción por monta natural. Se obtuvo aleatoriamente 460 muestras de suero sanguíneo en bovinos mayores de 4 meses de edad sin considerar sexo. Para la detección de anticuerpos contra Chlamydophilia abortus se usó el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) indirecto de uso comercial. Se obtuvo una prevalencia corregida de 40.34% + 7.06% (74/184) en bovinos que presentaron anticuerpos contra Chlamydophilia abortus; donde la menor prevalencia corregida fue en el distrito de Coracora con 40.29% + 8.89% (47/117) y la mayor prevalencia corregida en el distrito de Pullo con 56.05% + 7.15% (19/34). La alta prevalencia encontrada confirma la diseminación del patógeno en la población bovina de los distritos evaluados. Los resultados serológicos obtenidos, recomiendan considerarse a C. abortus como uno de los posibles agentes causales de aborto en bovinos en la región. Palabras clave: Chlamydia, anticuerpos, bovino, ganado, crianza extensiva (Fuente: MeSH) ABSTRACT The objective from this study is to determinate the prevalence of antibodies against Chlamydophila abortus in cattle in the districts of Coracora, Chumpi and Pullo of the Parinacochas province of the department of Ayacucho during 2018 where the cattle are raised extensively and with reproduction by natural mount. The 460 samples of bovine blood serum older than 4 months of age were randomly obtained without considering sex. For the detection of antibodies against Chlamydophilia abortus, the indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for commercial use was used. The corrected prevalence was 40.34% + 7.06% (74/184) in bovines presented against to Chlamydophilia abortus antibodies; the minimum corrected prevalence in the Coracora district was estimated with 40.29% + 8.89% (47/117) and the highest corrected prevalence in the Pullo district with 56.05% + 7.15% (19/34). The high corrected prevalence of antibodies confirm the bacterial spread in the bovine populations of the evaluated districts. The obtained serological results recommend considering C. abortus as one of the possible causative agents of abortion in cattle in the region. Key word: Chlamydia, antibodies, bovine, cattle, breeding extensive (Source: MeSH) INTRODUCCIÓN La crianza bovina en el Perú es principalmente de doble propósito (carne/leche), teniendo una distribución del 78% en la sierra, el 11% en la costa y el 10% en la selva. La provincia de Parinacochas, se caracteriza por una crianza extensiva de ganado bovino, con una población de 49,275 cabezas de ganado (Aronés y Castillo, 2003; INEI, 2012; Rosemberg, 2012). La ganadería bovina como fuente de producción de carne y leche es una de las principales actividades económicas en toda la región, siendo afectada por las enfermedades reproductivas que producen importantes pérdidas económicas. Se estima que las enfermedades infecciosas de tipo reproductivas reducen en alrededor del 10% la tasa anual de destete por abortos esporádicos que pueden afectar a un 20% de las vacas preñadas perjudicando la producción láctea (Kemmerling et al., 2009; Rojas et al., 2018). Siendo, Chlamydophilia abortus (C. abortus) uno de los patógenos principalmente relacionados a perdidas reproductivas, y cuya vía de diseminación del patógeno está relacionada a descargas uterinas, placenta, y secreciones reproductivas relacionadas al ternero abortado, contaminando durante meses las áreas de crianza (Entrican et al., 2001; Caro et al., 2009). La C. abortus, es una bacteria gramnegativa intracelular obligada eucariota, y cuyo órgano diana es la placenta (Everett et al., 2000; Longbottom y Coulter, 2003; Pospischil et al., 2010; Cheong et al., 2019). Se desarrolla en un medio ambiente extremo, presentando un ciclo con dos formas: un cuerpo elemental (CE) infeccioso, metabólicamente inerte y un cuerpo reticulado (CR), metabólicamente activo que sólo se encuentra dentro de las células (Caro et al., 2009; Orellano, 2016). Este patógeno pertenece al orden de los Clamidiales, familia Chlamidiaceae, y presentan 02 géneros, Chlamydia y Chlamidophila, los cuales tienen nueve especies en total (Longhbottom y Coutler, 2003; Quinn et al., 2005). C. abortus es un patógeno con amplia distribución mundial; además, es la mayor causa de abortos en vacas, ovejas, cabras, y agente zoonótico para el humano (Orellano, 2016; Cheong et al., 2019). Las presentaciones de la mayoría de los casos ocurren en sistemas de crianza intensivos donde el hacinamiento toma importancia sobre todo en periodos de parto, causando principalmente trastornos reproductivos e infertilidad (Karlsson et al., 2010; Bhandi et al., 2019). La transmisión generalmente es a través de la ruta horizontal por ingestión o inhalación; además, se reporta la transmisión venérea dependiendo potencialmente de la carga bacteriana presente en el semen (Cheong et al., 2019). C. abortus normalmente ingresa a las tonsilas, permitiendo la primera replicación posterior a la ingestión de las formas infectivas, luego se disemina por la sangre y linfa; en el caso de animales no gestantes la C. abortus permanece latente en los tejidos linfoides (Da Silva et al., 2006). Posteriormente, se puede generar una infección a nivel de la placenta (Pospischil et al., 2010), desarrollándose la infección en células del epitelio coriónico, causando grandes inclusiones citoplasmáticas. La infección, produce en una pérdida de células epiteliales coriónicas involucrando a los cotiledones y tejido adyacente, con necrosis focal; desencadenando posteriormente el aborto o parto prematuro (Orellano, 2016). La respuesta inmune en bovinos, es efectiva para eliminar el patógeno y proporciona protección a la reinfección por la misma cepa, pero tiende a disminuir de cuatro a seis meses post-infección (Pospischil et al., 2010). Los abortos se presentan de forma inesperada en los bovinos, relacionadas al último tercio de gestación (Albarracin, 2010). Los signos clínicos y lesiones más resaltantes en vacas gestantes son: vasculitis con compromiso necrótico, corion placentario con focos necróticos, e inclusiones citoplasmáticas; las descargas vulvares y fiebre se presentan hasta en 48 horas antes del aborto; flujo nasal, sialorrea, lagrimeo, tos, inapetencia (Buxton et al., 2002; Diaz et al., 2005; Dirksen et al., 2005; Diabs et al., 2011). En América del sur, existen diferentes reportes sobre la enfermedad, en Argentina se encontró 4,78%, en Brasil con 1.42% de prevalencia en bovinos; y en Perú se reporta un 21.54% (202/938) de ovinos seropositivos en el centro de producción de la Sais Túpac Amaru del departamento de Junín (Silva et al., 2009; Sánchez et al., 2014; Rojas et al., 2018). Para un óptimo diagnóstico, se debe tomar una buena muestra (sangre, tejidos fetales y membranas placentarias), y complementarlo con la historia clínica de los casos presentados (Stuen y Longbotton, 2011). La Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), plantea como prueba de diagnóstico estándar a la técnica de fijación de complemento, la cual ha sido tradicionalmente el procedimiento más utilizado para detectar C. abortus; sin embargo, existe la reactividad antigénica cruzada entre C. abortus y C. pecorum, careciendo su especificidad por el antígeno (Vretou et al., 2007; Sachse et al., 2009); por ello, para una mejor detección chlamydial, se considera a la prueba de ELISA como la más específica y de mayor eficacia diagnóstica para C. abortus (Longbottom y Coulter, 2003). Por todo ello, el estudio busca evaluar la presencia de anticuerpos de C. abortus en el ganado bovino de crianza extensiva, debido a su carácter zoonótico y la importancia en el aspecto reproductivo del ganado bovino (Wittenbrink et al., 2002). II. MATERIALES Y MÉTODOS Lugar de Estudio y Animales La investigación se realizó en los distritos Chumpi (latitud sur 15° 5′ 41″ , longitud oeste 73° 44′ 53″ con altitud de 3.207 msnm ), Coracora (14°41′38″Sur 74°07′27″ Oeste con altitud de 3178 msnm) y Pullo (14°41′38″Sur 74°07′27″ Oeste con altitud de 2 996 msnm) de la provincia de Parinacochas, ubicada al sur de Ayacucho; presentando una altitud desde los 2800 hasta los 3500 msnm (Aronés y Castillo, 2003), con un sistema de crianza es extensivo. Tamaño Muestral El cálculo del tamaño de muestra se realizó según la fórmula de tamaño de muestra para poblaciones finitas (Wayne, 2012). La población total evaluada fue de 49,275 bovinos, distribuidos en 27,063 bovinos en el distrito de Parinacochas, 13,988 bovinos en el distrito de Coracora, 7,736 Pullo y 5,339 de Chumpi; considerando estudios previos con una prevalencia del 4.78% de bovinos en Argentina (Rojas et al., 2018), un nivel de confianza de 95% y un error de 5%, donde se obtuvo un tamaño de muestra de 62 bovinos. Dónde: N: Tamaño de población (27063 bovinos) (INEI, 2012) n: Tamaño mínimo de muestra p: Proporción del atributo de interés de la población (4.78%) (Rojas et al., 2018) Z: Coeficiente de confianza (95% = 1.96) E: Error absoluto o error máximo admisible (5% = 0.05) Resultando n = 62 bovinos como tamaño de muestra, luego de estratificar las muestras requeridas para cada distrito según su población referencial, para Chumpi (12.2=12), para Coracora (32.1=32), y para Pullo (17.7=18) animales a muestrear, el cual se incrementó a 184 bovinos debido a efectos de minimizar el error de muestreo y por disponibilidad de materiales. Colección de Muestras La selección de muestras fue aleatoria. Se escogieron animales de cada establecimiento considerando mayores a 4 meses de edad, sin considerar el sexo. La toma fue por punción en la vena yugular con el uso de agujas Nº 18 y tubos al vacío de 10mL. Luego, los tubos fueron rotulados y transportados al laboratorio del Centro de Salud de la ciudad de Coracora, centrifugadas a 1600 g en 5 minutos, y se obtuvo el suero sanguíneo para ser congelado a -20 ºC hasta el momento de su procesamiento. Técnicas de laboratorio Las muestras fueron procesadas en el laboratorio de Microbiología y Microscopía veterinaria de la Universidad Científica del Sur, Lima, para confirmar la presencia de anticuerpos de C. abortus mediante la técnica de ELISA indirecto, utilizando para ello el Kit IDEXX Chlamydiosis Total Ab. Análisis de datos La seroprevalencia se expresó en porcentajes y la seroprevalencia corregida mediante la fórmula de Thrusfield (1990) tomando en cuenta la sensibilidad (99.7%) y especificidad (100%) de la prueba técnica de diagnóstico de ELISA IDEXX Chlamydiosis Total Ab, con sus respectivos intervalos de confianza (IC) al 95%. Además, se evaluó la asociación entre la presencia de anticuerpos contra C. abortus frente a la edad, sexo y procedencia de los bovinos mediante la prueba de Chi cuadrado (X2) (Thrusfield, 1990; Martínez, 2009). RESULTADOS Se observó que un 40.34 + 7.06% (74/184) resultaron positivos a anticuerpos contra C. abortus (cuadro 1). A nivel de los distritos, Pullo presenta la mayor cantidad de animales positivos 56.05 + 7.15% (19/34).En categoría zootécnica las Vacas son las de mayor número de animales positivos 39.70 + 7.05% (57/144) de anticuerpos contra C. abortus, sólo se muestreo un ternero menor a 6 meses de edad que resultó positivo. Respecto al sexo de los bovinos evaluados, la presencia de anticuerpos contra la C. abortus presentó 35.11 + 6.87% (7/20) de las muestras positivas de machos, y un 40.97 + 7.08% (67/164) de las muestras positivas en hembras (cuadro 1). Se determinó que no hay asociación estadística significativa (p>0.05) entre el sexo y el resultado positivo a la presencia de anticuerpos contra C. abortus, analizado mediante la prueba de Chi cuadrado (X2). Cuadro 1. Seroprevalencia de C. abortus (n= 184) en bovinos de crianza extensiva de los distritos de Coracora, Chumpi, y Pullo de la provincia de Parinacochas - 2018, Ayacucho Nº bovinos Positivos muestreado Prevalencia Variable (n) s Prevalencia (%) ±IC corregida (%) ±IC Sexo * Macho 7 20 35.00 + 6.87 35.11 + 6.87 Hembra 67 164 40.85 + 4.47 40.97 + 7.08 Categorías Zootécnica* Ternero 1 1 100.00 + 4.32 100.30 + 4.33 Vaquilla 7 13 53.85 + 7.18 54.01 + 7.18 Torete 3 13 23.08 + 6.07 23.15 + 6.07 Vaca 57 144 39.58 + 7.04 39.70 + 7.05 Toro 3 6 50.00 + 7.20 50.15 + 7.20 Vaquillona 3 7 42.87 + 7.13 42.99 + 7.13 Raza * Criollo 42 103 40.78 + 7.08 40.90 + 7.08 Holstein 2 4 50.00 + 7.20 50.15 + 7.20 Brown Swiss 22 44 50.00 + 7.20 50.15 + 7.20 Simmental 8 33 24.24 + 6.17 24.31 + 6.18 Procedencia** Chumpi 8 33 24.24 + 6.17 24.31 + 6.18 Coracora 47 117 40.17 + 7.06 40.29 + 7.06 Pullo 19 34 55.88 + 7.15 56.05 + 7.15 Estado Reproductivo* Vacía 54 140 38.57 + 7.01 38.69 + 7.01 Preñada 3 4 75.00 + 6.24 75.23 + 6.22 Sub total 57 144 39.58 + 7.04 39.70 + 7.05 Total 74 184 40.22 + 7.06 40.34 + 7.06 *La variable sexo, categoría zootécnica, raza y estado reproductivo, frente a anticuerpos de C. abortus no presentan asociación estadísticamente significativa (p>0.05). ** La variable procedencia, frente a anticuerpos de C. abortus presentan asociación estadísticamente significativa (p<0.05). Figura 1. Diagrama de caja de bigotes de la edad de bovinos evaluados según resultado a la prueba diagnóstica de Chlamydophilia abortus. El diagrama de caja y bigotes muestra la dispersión de los valores de las edades de los bovinos evaluados en el estudio. La mediana fue de 5 años tanto para los bovinos positivos y negativos, y se puede determinar una simetría similar de edades para ambos resultados. Mediante la prueba de Kolmogorov –Smirnov no se determinó diferencia estadística significativa (p>0.05) para la edad del bovino y los resultados a la prueba diagnóstica utilizada (Figura 1). En los positivos se observa dos puntos atípicos de edades muestreadas. El rango de las edades de animales negativos a la prueba osciló entre 4 meses a 11 años, siendo negativos en su mayoría las edades que comprenden de 3 a 6 años y teniendo como mediana 5 años. Por otra parte, las edades de animales positivos C. abortus oscilan entre 4 meses a 12 años, siendo positivos en su mayoría los animales de 3 a 10 años y teniendo como mediana 5 años. Figura 2. Diagrama de caja de bigotes de la cantidad de bovinos positivos y negativos a la prueba diagnóstica a C. abortus de acuerdo al número de partos. La dispersión en número de partos y los resultados a la prueba diagnóstica es simétrica para las vacas evaluadas. El rango de animales negativos a la prueba oscila entre 1 a 6 partos, siendo el 50% de las vacas evaluadas entre 2 a 4 partos y teniendo como mediana 3 partos. Por otra parte, los animales positivos a C. abortus oscilan entre 1 a 6 partos, siendo positivos en su mayoría los animales que tuvieron de 2 a 4 partos. A nivel del número de partos frente a la infección por C. abortus, no se encontró diferencia significativa (p>0.05). DISCUSIÓN La prevalencia corregida de anticuerpos contra C. abortus en el presente estudio (Cuadro 1) fue 40.34% + 7.06% (74/184). Existen diversos reportes a nivel mundial con índices de prevalencia reportada entre 4.78% hasta 71% de seropositividad, mostrando que la enfermedad tiene un comportamiento muy variable, potencialmente influenciado por diversos factores como: El hacinamiento, en sistemas de manejo donde los animales se congregan estrechamente durante el período de parto, el contacto, con otros rumiantes domésticos o salvajes; la infección se da por ingestión del patógeno en alimentos contaminados, o por lamer animales contaminados con líquidos o tejidos placentarios, también inhalando aerosoles creados en los ambientes contaminados (Nietfeld, 2001; Wang et al., 2001; Ndengu et al. 2018; Rojas et al., 2018; Bhandi et al., 2019). Estas prevalencias tan variables han sido reportadas en bovinos en Taiwan (Wang et al., 2001), en Brasil (Igayara-Souza et al., 2004), en Polonia (Niemczuk, 2005), en Alemania (Biensenkamp-Uhe et al., 2007), en Suecia (Godin et al., 2008), en la Pampa Argentina (Rojas et al., 2018), en Zimbabwe (Ndengu et al., 2018). Así mismo, en el Reino Unido y en Norte América, C. abortus es reconocida como el patógeno más común causante de abortos infecciosos y de pérdidas reproductivas en el ganado bovino, ovino y caprino (Longbottom y Coulter, 2003; Edmondson et al., 2012; Sánchez et al., 2014). En Zimbabwe un estudio puso en evidencia la seropositividad de C. abortus y la proximidad de contagio de cabras en vida silvestre con animales domésticas. En Namibia, las granjas presentan prevalencias de 25% y 86%, como también de manera individual en cabras la seroprevalencia en un rango de 2.4% a 54%. Además, los autores del estudio sugieren un probable ciclo independiente de infección por clamidias en búfalos (Solomon Bhandi et al., 2019). Así mismo otro estudio en Zimbabwe, presentaron seroprevalencias asociadas entre bovinos y vida silvestre, detectando anticuerpos contra C. abortus en búfalos (47.7%) e impalas (43.8%) (Ndengu et al., 2018). La seroprevalencia corregida encontrada en el presente estudio podría explicarse, por diferentes factores que influyen en la transmisión y diseminación del patógeno (Karlsson et al., 2010; Bhandi et al., 2019); aunque algunos autores, que identifican al hacinamiento como uno de los factores principales para la transmisión de la enfermedad, en las condiciones de crianza extensiva de la región en estudio, el hacinamiento no es frecuente, por lo que el contagio podría deberse a pastos contaminantes, aerosoles de otros animales (inhalación de aire contaminado), lamer fómites donde hubieron animales infectados o muertos (Kauffold et al., 2014). Con relación a las variables evaluadas, procedencia si reporta asociación significativa (p<0.05) con el diagnóstico positivo. La localidad de Pullo es la más afectada, con una prevalencia corregida de 56.05% + 7.15% (19/34), mientras la localidad de Coracora fue la menos afectada con una prevalencia corregida de 40.29% + 7.06% (47/117) de animales positivos a C. abortus (Cuadro1). Esta asociación puede deberse a una mayor densidad animal por ganadero y a condiciones medio ambientales más adversas encontradas en el distrito de Pullo; garantizando un mayor contacto debido por la mayor densidad animal, y otras características como las áreas de pastoreo, libres y sin límites determinados y sin mayor supervisión del criador o de la entidad que se encarga de monitorear (Longbottom y Coulter, 2003). Esto podría deberse al mayor número de animales en algunas localidades, ya que existe evidencia de una marcada asociación significativa (p<0.05) entre el número de ganado y la positividad a la infección (Al-Qudah et al., 2004). En relación a la variable sexo, esta no presento asociación significativa (p>0.05). Las hembras es la categoría que presenta mayor prevalencia corregida de 40.97% + 7.08% (67/164), mientras la categoría Macho presenta una prevalencia corregida de 35.11% + 6.87% (7/20). A diferencia de este hallazgo, existen reportes que reconocen como principal fuente de infección a los tejidos abortados, descargas vaginales y/o neonatos contaminados (Edmondson et al., 2012); por lo tanto, las hembras son consideradas fuente de transmisión del patógeno, y representan un factor de riesgo potencial en la epidemiología de la enfermedad. Además, existen hembras que generan inmunidad incompleta, ya que estas continúan eliminando el patógeno posterior al parto y/o celos post infección (Longbottom y Coulter, 2003). Por otro lado, el rol del macho es reconocido como menor en la epidemiología de la enfermedad por C. abortus; porque la vía de transmisión con más reportada para la C. abortus es por la vía del contacto oro-nasal con tejidos y secreciones reproductivas. Sin embargo, existe evidencia limitada de que los machos transmiten el agente mediante la cópula; a pesar que, si hay evidencia de la propagación en los testículos, pues es posible la detección en el semen, y no se considera al macho como factor de riesgo (Edmondson et al., 2012; Sánchez et al., 2014). Todo ello explica, las prevalencias similares encontradas en machos y hembras de este estudio, y dicha diferencia numérica puede ser solo circunstancial, influenciada potencialmente por la liberación intermitente de la bacteria por los hospedadores (Yin et al., 2014), el momento del muestreo, y otros factores que dificultan un diagnóstico preciso. La variable categoría zootécnica tampoco mostró una asociación significativa (p>0.05), con el diagnóstico positivo; siendo la categoría Vaca, la más afectada con una prevalencia corregida de 39.70% + 7.05% (57/144). Además en la evaluación de estado reproductivo tampoco mostro asociación estadísticas significativa (p>0.05); mientras la categoría de torete fue la menos afectada con una prevalencia corregida de 23.15% + 6.07% (3/13). Sin embargo existen reportes, que evidencian prevalencias altas de C. abortus en vacas aparentemente sanas que abortan (51%) y vacas con historial de aborto (71%) (Wang et al., 2001); lo que demuestra que la vía de transmisión es múltiple, y aun siendo baja la transmisión venérea también es posible (Karlsson et al., 2010). Nuestros resultados dan una distribución sin diferencias significativas en las diferentes categorías zootécnicas, y esto debido a que el patógeno es capaz de infectar a los bovinos de cualquier categoría zootécnica (Longbottom y Coulter, 2003), lo cual ha sido confirmado por un estudio en cabras (Al-Qudah et al., 2004). Por otro lado, la variable de raza, no mostró una asociación significativa (p>0.05). La raza Brown swiss fue las más afectadas con la infección por C. abortus (50%), mientras la raza menos afectada fue la criolla (40.90%). La raza Brown Swiss es la más afectada en la localidad de Coracora, siendo esta diferencia solo numérica circunstancial en la región y momento del estudio. Sin embargo, esta diferencia numérica no es significativa, y no se ha encontrado evidencia bibliográfica alguna; a pesar de la necesidad de adaptación tanto al clima, altitud y resistencia a enfermedades de algunas razas (FAO, 2010). Por último, el presente estudio representa la primera investigación epidemiológica de aborto bovino por C. abortus en el Perú. Los resultados serológicos obtenidos, recomiendan considerarse a la C. abortus como uno de los posibles agentes causales de aborto en bovinos del Perú. CONCLUSIONES ● La prevalencia corregida de anticuerpos contra C. abortus en el presente estudio fue de 40.34% + 7.06% (74/184) en la región de estudio ● La variable de procedencia, si reporta asociación significativa (p<0.05) con la positividad a la infección, donde la localidad de Pullo es la más afectada. 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