Facultad de Ciencias Veterinarias y Biológicas Carrera de Medicina Veterinaria y Zootecnia “LA IMPORTANCIA DE LA CAPACITACIÓN ESPERMÁTICA EN LA ALPACA” Trabajo de investigación para optar por el Grado Académico de: BACHILLER EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTENICA Presentado por: MELISSA MARGARET VILCA SULCA Lima – Perú 2019 2 ÍNDICE GENERAL 1. Introducción ………………………………………………………………………… 3 2. Revisión Bibliográfica ………………………………………………………….…... 5 2.1. Reproducción en alpaca macho…………………………………………….…... 5 2.2. Biotecnologías reproductivas en alpaca ……………………………………...… 6 2.3. Espermatozoide de alpaca………………………………………......................... 7 2.3.1. Capacitación espermática…………………………………………..………... 8 a) Bicarbonato (HCO3-)……………………….…………...…………..…… 10 b) Aceptores de colesterol…………………………,,,,,,,………………….... 11 c) Calcio (Ca2+)………………………………...……………….…………... 11 2.3.2. Capacitación espermática in vitro………………………………………….... 12 2.3.2.1. Medios de capacitación in vitro…………………………………..…. 12 3. Conclusión…………………………………………………………………..………….. 14 4. Referencias Bibliográficas……………………………………………………….……... 15 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Asas de túbulos seminíferos, red testicular y el conducto epididimario del morueco……………………………………………………………………………………... 8 Figura 2. Señales de capacitación: propuesta de secuencia de capacitación in vitro en espermatozoides de mamífero………………………………………………………………. 9 3 1. Introducción La crianza de alpacas es una actividad económica de gran importancia para las poblaciones alto andinas del Perú por la producción de fibra de gran finura y carne de alto valor nutricional (MINAGRI, 2019). La necesidad de optimizar la producción de animales con genética superior, promueve el empleo de diversas biotecnologías reproductivas. Según Díaz H., Espinoza J., Huanca W., Lopez-Torres B. y Rodríguez J. (2015), su desarrollo y aplicación se ve limitada por las propias características de la especie, requiriendo mayor conocimiento de la biología reproductiva de la especie, siendo de gran interés la fisiología reproductiva del macho. Los espermatozoides atraviesan cambios estructurales y bioquímicos durante su recorrido por el tracto reproductivo de la hembra, donde se encuentran agentes capacitantes que activan la maquinaria molecular para que sea capaz de fecundar un ovocito de manera efectiva. Este proceso, denominado capacitación espermática, incluye la hiperactivación de la motilidad espermática y la preparación de los espermatozoides para la reacción acrosómica (Muro Y., Hasuwa H., Isotani A., Miyata H., Yamagata K., Ikawa M., et al., 2016). Para el empleo de gametos del macho en diversas tecnologías in vitro, es necesario la obtención de espermatozoides capacitados, por lo que se busca replicar las condiciones pro capacitantes que se encuentran de manera natural. Si bien esto fue realizado con éxito en espermatozoides de diversas especies domésticas usando medios de capacitación especialmente formulados para cada una de ellas; en la alpaca, no se cuenta con estudios suficientes sobre este proceso y los factores que conllevan a dicho estado funcional. En esta especie se ha probado el uso de medios capacitantes como Ham F10 y albumina sérica bovina (Manosalva I., 2003; Uriondo H., Alvarez C., Rodríguez C., Uipan P. y Valdivia M., 4 2008), criocapacitación (Canorio N., 2008), etc., pero no se ha logrado una gran capacidad de unión a la zona pelúcida. Por lo mencionado anteriormente, el objetivo de este trabajo es realizar una revisión sobre el proceso de capacitación espermática y los factores que regulan este proceso in vivo, para comprender el desarrollo de los medios de capacitación espermática que se podrían aplicar en la alpaca. 5 2. Revisión literaria 2.1. Reproducción en alpacas macho El conocimiento de la biología reproductiva de la alpaca macho, así como el comportamiento sexual, anatomía y características seminales, son necesarios para un adecuado manejo reproductivo de la especie. Al año de edad, los machos manifiestan interés sexual y aptitud de monta hacia las hembras; sin embargo, todos presentan el pene adherido por completo al prepucio, por lo que se impide una cópula efectiva. Esta adherencia desaparece gradualmente durante su crecimiento, bajo la influencia de la testosterona. A los dos años de edad, cerca del 70 % de los machos presenta el pene liberado del prepucio y el 100% a los tres años (Hafez E. S. E. y Hafez B., 2007). Por otro lado, la madurez del sistema reproductivo inicia a los 12 meses de edad, apareciendo los primeros espermatozoides en la cabeza del epidídimo a los 18 meses. Entre los 20 y 24 meses, la espermatogénesis es más evidente. Todos los machos con más de tres años presentan esperma en el epidídimo de cada testículo (Montalvo C., Cevallos E. y Copaira M., 1979). Así mismo, estudios previos mencionan que el tamaño testicular podría ser usado como un indicador de producción espermática y, por lo tanto, de la fertilidad. Los testículos son elípticos y pequeños, en promedio miden entre 4 a 5 cm de longitud (Sumar J., 1983). Abraham M. C., Puhakka J., Ruete A., Al-Essawe E. M., De Verdier K., Morrell J. M. y Båge R. (2016) sugieren que los individuos cuya longitud testicular sea mayor a 3.8 cm estarían produciendo esperma. Por lo mencionado, uno de los principales obstáculos de la especie bajo los manejos tradicionales es que los machos se destinen a la reproducción a partir de los tres años. En cuanto a las características seminales de alpaca son muy variables entre individuos diferentes y respecto al número de eyaculados consecutivos de un mismo 6 macho (Morton K. M. y Maxwell W. C., 2006), los cuales son influenciados por factores medioambientales y de la misma especie (Huanca T., Mamani R., Naveros M. L. y Gonzales M., 2012). El eyaculado está constituido por plasma seminal (85%) y espermatozoides (15%). La coloración varía de blanco lechoso a blanco cristalino, dependiendo de la concentración espermática. El volumen es escaso (1.62 ± 1.82 ml) (Huanca et al., 2012) y con una alta viscosidad (Bravo P. W., Flores U., Garnica J. y Ordonez C., 1997). Esta característica dificulta su manejo en el laboratorio (pipeteo, dilución), así como determinar parámetros de concentración y motilidad espermática, la cual es de tipo oscilatoria y muy lenta (Sumar J, 1997). La concentración espermática es baja, a diferencia de otras especies domésticas, con valores de entre 30 a 150 x 106 espermatozoides/ml (Bravo PW., 1995). 2.2. Biotecnologías reproductivas en alpacas El desarrollo de biotecnologías reproductivas como la inseminación artificial, transferencia de embriones y protocolos para la fecundación in vitro contribuyen a obtener una mayor cantidad de animales genéticamente superiores (Huanca et al., 2012). En las alpacas, contribuirá a mejorar los índices de fertilidad (Apaza N., Olarte U. y Málaga J., 1998), natalidad anual (Fernández S, 1993) y de preñez (Apaza N., Sapana R., Huanca T. y Huanca W., 2001) que no superan el 65%, 50% y 60%, respectivamente. Sin embargo, se ve limitado por el desconocimiento de la fisiología reproductiva de la especie (Huanca W et al., 2007). La tecnología que más desarrollo ha tenido en los últimos años, principalmente en el ganado bovino, ha sido la fecundación in vitro (FIV) (Miragaya M. H., Chaves M. G., y Agüero A., 2006). Este es un proceso por el cual se cultivan espermatozoides previamente capacitados y ovocitos maduros para la obtención de un embrión. 7 Para el desarrollo de los protocolos de FIV en alpaca se debe tener en consideración el estudio de los procesos de recuperación y maduración de los ovocitos y espermatozoides. En el caso de los ovocitos, se ha tenido reportes de su recuperación vía laparotomía, obteniéndose una tasa de recuperación del 83% (105/127) en animales tratados con Hormona folículo estimulante (FSH) y 82% (163/198), en animales tratados con gonadotropina coriónica equina (Ecg) (Gómez C, Ratto MH, Berland M, Wolter M y Adams GP., 2002); mientras que Ratto M., Gomez C., Berland, M. y Adams G. P. (2007) obtuvieron 89% y 87% en animales tratados con FSH y eCG, respectivamente. Por otro lado, Ruiz J. A., Correa J. E., Ayuque G., Landeo L., Yaranga M., y Zacarías A (2007) maduraron ovocitos de alpaca durante 27 horas en el medio TCM-199 suplementado y obtuvieron un 75% de tasa de maduración. En cuanto a las células espermáticas, estas deben alcanzar su capacidad fecundante a través de un proceso de preparación in vitro. 2.3. Espermatozoide de alpaca La espermatogénesis es un proceso de división y diferenciación celular por el cual las espermatogonias, diploides, dan lugar a espermatozoides haploides. Estos son células altamente diferenciadas que se dividen en cabeza y flagelo. La cabeza consiste en el núcleo, algunas estructuras del citoesqueleto y el citoplasma. El cuello une la cabeza a la cola o flagelo. Esta es la parte encargada del movimiento y se subdivide en segmento medio, principal y terminal (Eddy y O'Brien, 1994). El espermatozoide está cubierto por la membrana plasmática. Entre esta estructura y la porción anterior de la cabeza se encuentra el acrosoma. Los gametos son liberados en el lumen del túbulo seminífero para luego ser transportados por la red testicular y el conducto epididimario (Hafez, 2007) (Figura 1). 8 En la cabeza y cuerpo del epidídimo, los gametos sufren pequeños cambios metabólicos y estructurales con gran repercusión funcional, adquiriendo motilidad progresiva, pérdida de la gota citoplasmática desarrollo de la capacidad fecundante, y son almacenados en la cola del epidídimo (Hafez, 2007). Figura 1: Asas de túbulos seminíferos, red testicular y el conducto epididimario del morueco. La vía por la cual son transportados al exterior los espermatozoides se indican mediante las flechas. Modificado de Setchell BP. Fuente: Cole HH, Cupps PT. (1977). 2.3.1. Capacitación espermática Después de ser eyaculados, los espermatozoides no pueden fecundar los ovocitos inmediatamente. Chang (1951) y Austin (1951) observaron que estos deben entrar en contacto con el tracto reproductivo de la hembra para adquirir su capacidad fecundante. Durante su recorrido, principalmente en el oviducto (Bravo 9 P., Solis P., Ordoñez C. y Alarcón V., 1997c), los espermatozoides sufren cambios bioquímicos y estructurales, denominado capacitación espermática. Figura 2: Señales de capacitación: propuesta de secuencia de capacitación in vitro en espermatozoides de mamífero. Fuente: Gadella y Visconti (2006). Los eventos moleculares implicados al inicio de esta, incluyen: reordenamiento lipoproteico en la membrana plasmática que permite la disminución de la rigidez de la misma, exteriorización de receptores, activación de canales iónicos que incrementan el pH y calcio intracelular, fusión y vesiculación de membranas plasmática y acrosomal externa, alteración en los patrones de motilidad del flagelo y un aumento de la fosforilación de las proteínas (Gadella y Visconti, 2006). Cabe mencionar que el bicarbonato, calcio y los aceptores de colesterol son esenciales durante todo el proceso de capacitación (Figura 2). Como 10 resultado de esta, el espermatozoide incrementa su motilidad y adquiere la habilidad de experimentar la reacción acrosomal (Visconti, Krapf, De La Vega- Beltrán, Acevedo y Darszon, 2011). a) Bicarbonato (HCO3-) Muchos estudios han demostrado que el proceso de capacitación es dependiente HCO3- (Gadella y Harrison, 2000; Visconti P. E., Bailey J. L., Moore G. D., Pan D., Olds-Clarke P. y Kopf, G. S., 1995; Harrison, 2004; Boerke A., Brouwers J., Olkkonen V., Van de Lest C., Sostaric E., Schoevers E., et al., 2013). Cabe señalar que el bicarbonato se ha encontrado en bajas concentraciones en el epidídimo y elevadas en el plasma seminal y oviducto, por lo que se presume que juega un papel importante suprimiendo la capacitación en el primero y promoviéndola en los últimos mencionados (Rodriguez‐Martinez H., Ekstedt E., y Einarsson S., 1990). El movimiento transmembrana de este anión se asocia con el incremento intracelular del pH observado durante la capacitación (Parrish J., Susko-Parrish J. y First N., 1989). Por otro lado, el HCO3- es capaz de estimular la Adenil ciclasa (AC), enzima responsable de la síntesis del Adenosín monofosfato (AMPc) (Visconti P., Muschietti J., Flawia M. y Tezon, J., 1990). El AMPc activa a las protein kinasa (PKA), permitiendo la fosforilización de la protein-tirosina. La fosforilación de los residuos de tirosina permite la regulación de la movilidad del espermatozoide y el reconocimiento de la zona pelúcida (Vijayaraghavan S., Trautman K. D., Goueli S. A. y Carr D. W., 1997). Así mismo, el bicarbonato también modifica la estructura lipídica de la membrana plasmática utilizando la ruta AC /AMPc / PKA, 11 antes mencionada (Gadella y Harrison, 2000) permitiendo la reacción acrosomal del esperma y fecundación del ovocito. b) Aceptores de colesterol Los espermatozoides recién eyaculados presentan una relación colesterol/fosfolípdos (C/F) elevada, lo que genera la “rigidez” de su membrana plasmática por lo que no puede sufrir exocitosis acrosomal. Durante el tránsito en el tracto reproductivo de la hembra, el colesterol (CHOL) se mueve de la membrana plasmática hacia los aceptores de colesterol presentes en el fluido oviductal permitiendo la fusión de la membrana plasmática con la membrana acrosomal externa. La pérdida de colesterol permite la exposición de los receptores de membrana para la manosa (Sierra R. A. y Olivera M., 2000). c) Calcio (Ca 2+) Luego de la salida del colesterol de las membranas junto con activación de un canal de calcio en la membrana acrosomal externa por parte del PKA (Olivera M., Ruiz T., Tarazona A. y Giraldo C., 2006), el calcio extracelular ingresa al espermatozoide de manera masiva como consecuencia de la apertura de los canales dependientes del voltaje (CatSper 1 y 2) localizados en la cola del espermatozoide, por despolarización de la membrana plasmática, lo cual se encuentra relacionado a la motilidad hiperactivada del espermatozoide (Xia y Ren, 2009). El Ca2+ juega un papel muy importante junto con el HCO3- en la transducción de señales de la adenilato ciclasa (AC), enzima que regula el metabolismo del AMPc. (Chang y Suarez, 2011) 12 2.3.2. Capacitación espermática in vitro Para determinar los mecanismos moleculares involucrados en la capacitación de espermatozoides, se han utilizado medios de capacitación in vitro; es decir que se incuban los espermatozoides en tampones definidos químicamente que imitan los fluidos del tracto reproductivo de la hembra. Esto se ha realizado en espermatozoides de diversas especies de animales, especialmente mamíferos; pero se necesita de condiciones adecuadas como un medio de cultivo que contenga las sustancias pro capacitantes que activen el estado de capacitación, así como tiempo y temperatura adecuadas para alcanzar dicho fin (Jaiswal B., Cohen-Dayag A., Tur-Kaspa I. y Eisenbach M., 1998). a) Medios de capacitación espermática in vitro El contenido de los medios capacitantes varía de acuerdo a la especie en estudio, pero en general HCO3-, Ca2+ y albúmina son los componentes esenciales para la capacitación en todas las especies (Visconti P., Galantino-Homer H., Moore G., Bailey J., Ning X., Fornes M. y Kopf G., 1998). Por ejemplo, el medio Biggers, Whitten y Whittingham (BWW) comprende una solución salina equilibrada, una macromolécula, típicamente albúmina de suero bovino (BSA) o alcohol polivinílico, complementada con diversos sustratos energéticos como glucosa, piruvato y lactato, así como Ca2+ y HCO3. Este se ha utilizado de manera efectiva para incrementar la capacidad fecundante de los espermatozoides de una variedad de especies, incluyendo humanos, equinos, caninos y bovinos (Lin M., Zhang X., Murdoch R. N. y Aitken R. J., 2017). En el equino; los espermatozoides fueron diluidos utilizando este medio más albúmina sérica y cafeína 1 mM, asegurando capacitación espermática (Thomas A. D., Meyers S. A. y Ball B. A., 2006). Por otro lado, en espermatozoides epididimarios de 13 bovinos, se utilizó un medio de lavado buffer fosfato dextrosa que contenía 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 10 mM glucosa, 16.3 mM KH2Po4, y 100 U/ml de penicilina (Visesato M., Tapasi D., Maitreyi B. y Tapati C., 2007). En este mismo estudio también utilizaron 5 ml de BWW mencionado anteriormente y suplementado con heparina o albúmina sérica bovina (Thomas et al., 2006). En alpacas, se ha descrito el método de capacitación mediante el uso del medio HAM F10 junto con una concentración de albúmina sérica bovina (BSA) (Manosalva, 2003). Por otro lado, se ha estudiado la criocapacitación, en donde los espermatozoides luego de ser criopreservados presentan niveles elevados de calcio intracelular, evento que se asemeja a una capacitación espermática normal. Sin embargo, la capacidad de unión a la zona pelúcida de los espermatozoides criopreservados fue menor que la de los espermatozoides capacitados in vitro. A pesar de estos resultados, se pudo resaltar que los primeros no necesitan ningún tratamiento de capacitación in vitro para lograr dicho fin. (Canorio, 2008). También se ha evaluado el efecto del fluido folicular en la capacitación espermática, sin embargo, esto varía según la especie tanto en motilidad como en la reacción acrosomal. Bravo y Valdivia (2018), observaron el efecto del fluido folicular de alpaca (FFa) en la motilidad y reacción acrosómica de los espermatozoides de alpaca, utilizando un fluido folicular de tres tamaños de folículo: pequeño (< 3 mm), medio (3-6 mm) y grande (> 6 mm), en una concentración del 30%. Se concluyó que el tamaño folicular influye en el efecto del líquido folicular en el espermatozoide de alpaca, donde los folículos pequeños y medianos estimulan mejor la motilidad del esperma, pero la reacción del acrosoma se ve aumentada por el líquido folicular de los folículos pequeños y grandes. 14 3. Conclusión El espermatozoide es una célula especializada cuyo estado metabólico está determinado por el medio en el que se encuentre. Al atravesar el tracto reproductivo de la hembra, sufre cambios estructurales y bioquímicos, denominado capacitación espermática. Este proceso es indispensable para que ocurra la fecundación de un ovocito maduro. Con lo mencionado anteriormente, se concluye que es necesario reproducir las condiciones pro capacitantes mediante el uso de medios de capacitación para el desarrollo y aplicación de biotecnologías reproductivas, como la fecundación in vitro, y con ello, incrementar la tasa de concepción de la alpaca. Si bien, la capacitación in vitro fue realizada con éxito en diversas especies domésticas y se han estudiado los principales componentes de los medios (bicarbonato, calcio y albúmina); en la alpaca, no se cuenta con estudios suficientes sobre el proceso de capacitación y menos aún de qué factor conlleva a dicho estado funcional. 15 4. 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